朱宏 孫海艦 朱永康

（江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029）

青敷膏治療大鼠體表金黃色葡萄球菌感染的實驗研究

朱宏 孫海艦 朱永康

（江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029）

目的：研究青敷膏外用的作用機(jī)制。方法：SD大鼠隨機(jī)分為飴糖組（空白組）、百多邦對照組以及青敷膏低、中、高劑量組，建立大鼠體表感染模型，應(yīng)用相應(yīng)藥物或賦形劑外敷或涂抹，每隔24h換藥1次，共治療3d。用藥結(jié)束后對各組大鼠局部組織取材，包括真皮、皮下組織、肌層及結(jié)締組織，石蠟包埋、HE染色，觀察急性炎癥反應(yīng)以及中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤程度，細(xì)菌殘留及炎癥介質(zhì)IL-6、IL-10釋放情況。結(jié)果：青敷膏高劑量組在急性炎癥反應(yīng)指標(biāo)上明顯低于飴糖組及百多邦對照組，青敷膏中、高劑量組在單核細(xì)胞浸潤指標(biāo)上明顯低于青敷膏低劑量組、飴糖組，青敷膏高劑量組IL-6、IL-10指標(biāo)明顯低于飴糖組、百多邦對照組。結(jié)論：一定濃度的青敷膏具有抗炎、抑制白細(xì)胞浸潤、抑制炎癥介質(zhì)釋放的多重作用，對于體表感染金黃色葡萄球菌大鼠模型有明顯的治療效果。

金黃色葡萄球菌感染 青敷膏 實驗研究

江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑青敷膏是由青敷散與飴糖以一定比例調(diào)配而成，在臨床應(yīng)用數(shù)十年，對初起的體表感染具有清熱解毒、活血消腫止痛的作用，臨床效果良好，然而其作用機(jī)制仍然不很清楚限制了其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。本研究制作大鼠表皮炎癥模型，予青敷膏外敷，觀察治療后急性炎癥反應(yīng)以及中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤程度，細(xì)菌殘留及炎癥介質(zhì)IL-6、IL-10釋放情況，以探討青敷膏外用抗感染的作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 動物SD大鼠50只，雌雄各半，體重200～280g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證編號：SCXK（浙）2008-0033。

1.2 菌種金黃色葡萄球菌ACTT 25923，濃度1×107個/mL，由江蘇省中醫(yī)院細(xì)菌室提供。

1.3 藥物及制備低、中、高濃度青敷膏，調(diào)配方法：臨床所使用青敷膏，青敷散與飴糖重量比為1∶3，確定為中劑量組，低劑量組青敷散與飴糖重量比為1∶6，高劑量組青敷散與飴糖重量比為1∶2。飴糖，莫匹羅星軟膏（百多邦，中美天津史克制藥有限公司生產(chǎn)，批號13080406），10%水合氯醛（由江蘇省中醫(yī)院藥劑科提供）。

1.4 試劑與儀器蒸餾水、中性福爾馬林液（4%），由江蘇省中醫(yī)院病理科提供。層流臺、取樣器、注射器、顯微鏡、HE染色設(shè)備、電動剃毛器、膠帶等，由江蘇省中醫(yī)院病理科、南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

2 實驗方法

2.1 造模與分組應(yīng)用Elisabeth Kugelberg等[1]所設(shè)計的“膠帶剝脫法”建立大鼠表皮撕脫模型，然后在撕脫表皮部位滴注金黃色葡萄球菌液，作用約4h后完成細(xì)菌吸收[2-3]，經(jīng)檢測造模效果良好。

實驗大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別是青敷膏低、中、高劑量組和飴糖組（空白組）及百多邦對照組。大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（3mL/kg）麻醉，選擇大鼠背部皮膚作為實驗區(qū)，電動剃毛器剃去背部毛發(fā)，以寬約2cm膠帶連續(xù)粘扯背部軟毛，約30次左右脫去毛發(fā)和表皮層，以潮紅光亮見滲出為度，去除面積約3cm2。表皮剝脫后即刻于表皮剝脫處滴注5μL含1×107個/mL金黃色葡萄球菌菌液，靜置待蘇醒后單籠飼養(yǎng)。

2.2 給藥于滴注菌液后第2天，在創(chuàng)面應(yīng)用青敷膏（低、中、高劑量）、飴糖及百多邦進(jìn)行治療，每隔24h換藥1次，至第5天結(jié)束，共治療3d。青敷膏敷貼方法嚴(yán)格按我院方法施行，即以膏劑攤涂于綿紙上，厚約1mm，隔一層綿紙敷貼于創(chuàng)面，敷貼范圍大于炎癥腫脹范圍，外部以紗布2～4層覆蓋，膠帶紙環(huán)繞大鼠腹部，有效固定。飴糖組，以飴糖攤涂，敷貼方法同上。莫匹羅星軟膏（百多邦），按說明使用，用無菌棉簽蘸取后均勻涂抹于大鼠體表創(chuàng)面，實驗中統(tǒng)一用量。

2.3 取材方法用藥結(jié)束后脫頸椎處死大鼠，取脫皮局部靠近中心部包括皮膚至肌層各層組織約1cm2，置于中性福爾馬林（4%）中，分別行HE染色和革蘭氏染色，制作病理標(biāo)本切片。

2.4 檢測項目觀察病理切片的急性炎癥反應(yīng)、中性粒細(xì)胞浸潤、單核細(xì)胞浸潤、細(xì)菌殘留情況。并按照表1的計分方法進(jìn)行半定量檢測。

炎癥介質(zhì)測定：炎癥介質(zhì)IL-6、IL-10釋放采用免疫組化的方法進(jìn)行檢測。免疫組化染色采用SP法（一抗和二抗均購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）[4]，染色方法參照說明書進(jìn)行，顯色使用DAB。光學(xué)顯微鏡下觀察免疫表型。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)值結(jié)果采用多重比較（LSD）及Student-Newman-Keuls統(tǒng)計組內(nèi)差異。

3 實驗結(jié)果

各組大鼠病理切片的急性炎癥反應(yīng)、中性粒細(xì)胞浸潤、單核細(xì)胞浸潤、細(xì)菌殘留情況半定量檢測結(jié)果見表2。

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，致病菌從體表侵入人體后，可造成局部感染的發(fā)生。在體表感染的發(fā)生發(fā)展過程中主要病理變化有變質(zhì)、滲出和增生。一般病變的早期以變質(zhì)和滲出為主，病變后期以增生為主。炎癥早期即發(fā)生局部的血流動力學(xué)改變，這些改變包括血管擴(kuò)張和血流加速形成紅、熱現(xiàn)象，隨著血管擴(kuò)張，血管通透性的升高，富含蛋白質(zhì)的液體外滲出血管，導(dǎo)致血管內(nèi)紅細(xì)胞濃集和血黏度的增加，形成血流停滯，發(fā)生“瘀血”現(xiàn)象，一般損傷發(fā)生后的24～48h左右，此種現(xiàn)象最為明顯[5]。從中醫(yī)角度看，此時“形癥已成”，臨床可以應(yīng)用相應(yīng)的清熱解毒、活血消腫類外敷藥物治療[6]。炎癥反應(yīng)最重要的功能是將白細(xì)胞輸送到損傷部位，白細(xì)胞游出是炎癥反應(yīng)最重要的指征。游出的白細(xì)胞在炎癥局部可發(fā)揮吞噬和免疫作用，因而成為防御反應(yīng)極其重要的一環(huán)。除此之外，白細(xì)胞對局部組織還有損傷和破壞作用。實驗考察白細(xì)胞的浸潤情況具有重要意義[7]。以HE染色半定量方法可以檢測局部感染組織的炎癥反應(yīng)情況和藥物治療前后的中性粒細(xì)胞浸潤情況，在目前實驗研究中很容易做到且客觀可靠。

急性炎癥的血管擴(kuò)張、通透性增加和白細(xì)胞滲出的發(fā)生機(jī)制，除了某些致炎因子可直接損傷血管內(nèi)皮外，這些炎癥反應(yīng)主要是通過一系列化學(xué)因子的介導(dǎo)而實現(xiàn)的，這些因子稱為炎癥介質(zhì)。炎癥介質(zhì)作用于細(xì)胞可進(jìn)一步引起靶細(xì)胞產(chǎn)生第二級炎癥介質(zhì)，使最初炎癥介質(zhì)進(jìn)一步發(fā)揮作用或被抵消。這些炎癥介質(zhì)常見的有白細(xì)胞介素類、前列腺素類、血小板激活因子、一氧化氮以及激肽補(bǔ)體系統(tǒng)等等。其中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素10（IL-10）參與免疫信號通路的調(diào)節(jié)[7]。本實驗選擇IL-6、IL-10作為炎癥觀察指標(biāo)。由于激活了的單核細(xì)胞能生成并釋放多種細(xì)胞毒、干擾素和白細(xì)胞介素，單核細(xì)胞的浸潤減少，局部多種炎癥介質(zhì)的釋放亦相應(yīng)減少，從而減輕炎癥反應(yīng)。本實驗證明，青敷膏中、高劑量能抑制單核細(xì)胞浸潤，減少局部炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕局部炎癥反應(yīng)。

青敷膏（蘇藥制字Z04000387）系我院具有傳統(tǒng)特色的清熱解毒類外敷藥物，臨床使用數(shù)十年，效果良好。原方見于清·馬培之著《急救百病濟(jì)世回生良方》，稱為青敷藥，《中醫(yī)外科學(xué)》附編方劑以“青敷散”為名收錄。藥物組成為大黃、姜黃、黃柏各240g，白及180g，白芷、赤芍、天花粉、青黛、甘草各120g。本院的青敷膏是以青敷散加飴糖調(diào)制而成。功能清熱解毒、活血消腫止痛。主藥青黛清熱解毒、涼血消腫[8-9]；黃柏清熱利濕解毒[10-11]；天花粉、白芷等祛濕消腫、散結(jié)止痛[12-13]；大黃既能清熱又能祛瘀[14]。其賦形劑飴糖能夠保持敷藥的黏性和濕潤，促進(jìn)藥物成分的吸收。

本實驗證明，一定濃度的青敷膏具有抗炎、抑制白細(xì)胞浸潤、抑制炎癥介質(zhì)釋放的多重作用，對于體表感染金黃色葡萄球菌大鼠模型有明顯的治療效果。

表1 計分方法

表2 各組大鼠相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果（±s）分

表2 各組大鼠相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果（±s）分

注：*與飴糖組比較，P＜0.05；#與百多邦對照組比較，P＜0.05；△與青敷膏低劑量組比較，P＜0.05。

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編輯：吳寧

R632.05

A

1672-397X（2014）08-0074-02

朱宏（1980-），男，醫(yī)學(xué)碩士，主治中醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合普外科臨床工作。njtcm1998@163.com

2014-05-09