雷雯 繆婷玉 陳赟 盧蘇

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029）

滋腎清心湯對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠卵巢bcl-2和bax表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

雷雯1繆婷玉1陳赟2盧蘇2

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029）

目的：研究中藥滋腎清心湯對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠卵巢bcl-2和bax蛋白表達(dá)的影響，探討滋腎清心湯治療圍絕經(jīng)期綜合征可能的作用機(jī)制。方法：選用自然衰老的圍絕經(jīng)期雌性大鼠，隨機(jī)分為4組（每組10只）：更年期大鼠模型組（模型組）和滋腎清心湯高、中、低劑量組，另選10只青年雌性大鼠作為青年對(duì)照組。連續(xù)灌胃處理4周后，采用蛋白印跡（Western blot）及RT-PCR檢測(cè)大鼠卵巢中Bcl-2和Bax蛋白及基因的表達(dá)。結(jié)果：與模型組相比，滋腎清心湯高劑量能顯著降低卵巢組織中Bax蛋白的表達(dá)，顯著上調(diào)Bcl-2/Bax的比值；滋腎清心湯各劑量均能明顯降低卵巢組織中Bax基因表達(dá)，明顯升高Bcl-2基因表達(dá)，從而顯著上調(diào)Bcl-2/Bax比值，延緩卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。結(jié)論：滋腎清心湯通過調(diào)節(jié)圍絕經(jīng)期大鼠卵巢中凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax蛋白及基因的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2/Bax蛋白及基因的比值，從而延緩卵巢衰老，這可能是其治療圍絕經(jīng)期綜合征的分子機(jī)制之一。

圍絕經(jīng)期綜合征 滋腎清心湯 卵巢 細(xì)胞凋亡 bcl-2 bax 實(shí)驗(yàn)研究

圍絕經(jīng)期綜合征是指婦女在絕經(jīng)前后因?yàn)槁殉补δ芩ネ?，性激素水平波?dòng)而引起的一系列身體及精神心理癥狀。目前西醫(yī)主要采用激素替代療法（HRT）治療[1]，該方法具有嚴(yán)格的適應(yīng)證及禁忌證，大量臨床研究表明激素替代療法存在潛在的致癌危險(xiǎn)及其他不良反應(yīng)，多數(shù)患者難以接受。滋腎清心湯是在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，結(jié)合臨床工作經(jīng)驗(yàn)化裁而來，全方清心安神、滋腎養(yǎng)陰，臨床治療本病獲得較好的療效。本研究以卵巢細(xì)胞凋亡作為切入點(diǎn)，觀察滋腎清心湯對(duì)初老大鼠卵巢細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，探索滋腎清心湯在卵巢中可能的作用位點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，12～14月齡，40只，體重（350±20）g，經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，呈現(xiàn)出動(dòng)情周期紊亂、動(dòng)情間期延長(zhǎng)，確定為圍絕經(jīng)期鼠。4月齡大鼠10只，體重（200±20）g。大鼠均由浙江省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)條件：二級(jí)實(shí)驗(yàn)室，普通全價(jià)飼料喂養(yǎng)，自由攝水，室溫（24±2）℃，濕度45%～ 65%。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑滋腎清心湯，組方：蓮子心5g，黃連3g，鉤藤15g，炒酸棗仁15g，浮小麥30g，丹參10g，干地黃10g，山茱萸9g。中藥由江蘇省中醫(yī)院提供，水煎并濃縮，相當(dāng)于生藥3.2g/mL，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｖ兴巹┝堪慈梭w重60kg，5倍系數(shù)計(jì)算。內(nèi)參一抗（β-Actin）由Immunoway公司提供，二抗（羊抗小鼠IgG-HRP），二抗（羊抗兔IgG-HRP）由Jackson公司提供。cDNA第一鏈合成試劑盒和Taq DNA Polymerase由Thermo Fisher公司提供。Regular Agarose G10由Biowest公司提供。50×TAE電泳緩沖液由KeyGen公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥將更年期大鼠隨機(jī)分為4組：更年期大鼠模型組（模型組）和清心滋腎方高、中、低劑量組。另取10 只4月齡大鼠作為青年對(duì)照組。清心滋腎方高、中、低劑量組分別灌服滋腎清心湯32g/（kg·d）、16g/（kg·d）、8g/（kg·d）。每日給大鼠灌胃1次，連續(xù)4周。模型組和青年對(duì)照組給予生理鹽水10mL/（kg·d）。每日給大鼠灌胃1次，連續(xù)4周。大鼠末次給藥24h后斷頭處死，快速取出雙側(cè)卵巢，經(jīng)液氮速凍后于-70℃冰箱凍存，用于組織蛋白的檢測(cè)。

2.2 Western blot法檢測(cè)卵巢中Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)提取大鼠卵巢總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜，用質(zhì)量濃度為30g/L（0.03g/mL）的牛血清白蛋白（BSA）37℃封閉1h，再分別用Bcl-2、Bax和β-actin兔抗鼠多克隆抗體（1∶400）37℃孵育1h。TBST洗膜10min×3次，TBS洗膜10min。最后用ALP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶500）37℃孵育1h。TBST洗膜10min×3次，TBS洗膜10min。NBT/BCIP顯色。以β-actin作為內(nèi)參照。

2.3 RT-PCR方法檢測(cè)卵巢中Bcl-2、Bax的基因取卵巢組織進(jìn)行RNA提取，提取后進(jìn)行RNA濃度和純度的鑒定，經(jīng)鑒定符合實(shí)驗(yàn)要求后，進(jìn)行cDNA第一鏈合成（20μL體系），然后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。取滅過菌且無核酸酶的0.2mL離心管，在冰上依次加入如下組分：10×Taq Buffer 5μL；MgCl2（25mmol/L）4μL；dNTPs（10mmol/L）1μL；引物Ⅰ（10μmol/L）1μL；引物Ⅱ（10μmol/L）1μL；cDNA1μL；TaqDNA Polymerase 0.5μL；滅菌雙蒸水至總體積50μL。第一階段：95℃、5min預(yù)變性；第二階段：95℃、40s，56℃、40s，72℃、45s，32個(gè)循環(huán)，退火、變性、延伸；第三階段：72℃、10min最終延伸。引物序列及PCR產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列及PCR產(chǎn)物大小

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)治療后滋腎清心方各組均可升高圍絕經(jīng)期大鼠卵巢中的Bcl-2蛋白，與青年對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；降低Bax蛋白，與青年對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；升高Bcl-2/Bax蛋白的比值，與青年對(duì)照組比較中、低劑量組具有顯著性差異（P＜0.01），高劑量組未見差異性（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與青年對(duì)照組比較，▲▲P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)（只）Bax Bcl-2Bcl-2/Bax青年對(duì)照組100.4033±0.0581**1.0100±0.35232.3504±0.9792**模型組101.0333±0.1812▲▲0.5167±0.19060.4629±0.1980▲▲滋腎清心湯低劑量組100.9133±0.13170.5933±0.22820.6105±0.2620▲▲滋腎清心湯中劑量組100.7433±0.17850.7267±0.31870.9057±0.3589▲▲滋腎清心湯高劑量組100.5633±0.2255*0.8867±0.34971.5153±0.4794*

3.2 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax基因的表達(dá)見表3。

表3 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax基因表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax基因表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與青年對(duì)照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)（只）bax bcl-2Bcl-2/Bax青年對(duì)照組100.9990±0.1590**0.9994±0.0031*1.0005±0.0170**模型組108.8051±0.78870.1526±0.02970.01712±0.0020滋腎清心湯低劑量組106.4810±0.6566**▲▲0.2803±0.0216*▲0.0436±0.0063*▲▲滋腎清心湯中劑量組104.7383±0.5839**▲▲0.4732±0.0164*▲0.1009±0.0131**▲▲滋腎清心湯高劑量組102.5693±0.3544**▲▲0.6444±0.0045*▲0.2543±0.0384**▲▲

4 討論

圍絕經(jīng)期綜合征是婦女絕經(jīng)前后出現(xiàn)性激素波動(dòng)或減少所致的一系列身體及精神心理癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為婦女進(jìn)入圍絕經(jīng)期后，卵巢功能衰退，分泌的雌激素減少，卵泡期延長(zhǎng)，卵泡逐漸停止發(fā)育。由于雌激素分泌減少，對(duì)垂體的負(fù)反饋減弱，破壞了下丘腦—垂體—卵巢軸的平衡，產(chǎn)生下丘腦和垂體功能亢進(jìn)的現(xiàn)象[2]。這些內(nèi)分泌環(huán)境的變化導(dǎo)致腦內(nèi)β-內(nèi)啡肽和5-羥色胺水平異常，一氧化氮、內(nèi)皮素的異常，CD3+、CD4+減少、CD8+增加等，從而出現(xiàn)精神情緒變化失調(diào)，交感神經(jīng)系統(tǒng)、體溫調(diào)節(jié)中樞不穩(wěn)定，血管舒縮平衡失調(diào)，免疫功能降低等一系列臨床癥狀。

目前研究認(rèn)為是顆粒細(xì)胞的凋亡觸發(fā)卵泡閉鎖[3]。更年期婦女卵泡及顆粒細(xì)胞的急劇減少，產(chǎn)生的雌激素及促性腺激素受體減少，從而出現(xiàn)卵巢功能的減退。目前已經(jīng)闡明的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑主要有兩條：一條是細(xì)胞表面死亡受體途徑，另一條是線粒體途徑，這兩條途徑最終都匯集為Caspases家族蛋白酶的級(jí)反應(yīng)過程[4]。Bcl-2和Bax在線粒體應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。Bcl-2及Bax同屬于Bcl-2基因家族，Bcl-2能抑制細(xì)胞凋亡，Bax能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bax與bcl-2形成異二聚體復(fù)合物，維持促凋亡基因在細(xì)胞內(nèi)的定位分布，使細(xì)胞不進(jìn)入凋亡程序[5]。但當(dāng)Bax蛋白超表達(dá)時(shí)，Bax/Bax同源二聚體的數(shù)量明顯升高，細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)性增強(qiáng)，啟動(dòng)凋亡；當(dāng)Bcl-2表達(dá)增高時(shí)，Bax/Bax二聚體解離，生成穩(wěn)定的Bcl-2Bax異源二聚體，對(duì)抗Bax的誘導(dǎo)凋亡作用[6]。已有研究表明，一切促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的作用，都可歸結(jié)成Bcl-2/Bax比值的變化[7]。

為更確切地了解滋腎清心湯治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用位點(diǎn)，我們對(duì)Bcl-2、Bax同時(shí)進(jìn)行了基因和蛋白的檢測(cè)。結(jié)果表明，滋腎清心湯能夠促進(jìn)圍絕經(jīng)期大鼠卵巢組織中Bcl-2的表達(dá)，抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，并能抑制Bax誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用，從而延緩卵巢衰老，這可能是其治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)中采用RT-PCR與Westren blot檢測(cè)，對(duì)基因的調(diào)節(jié)作用較蛋白質(zhì)顯著。其原因可能是，在細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)是決定細(xì)胞基因表型及對(duì)外信息發(fā)生的反應(yīng)性，蛋白質(zhì)水平的表達(dá)不僅取決于基因轉(zhuǎn)錄的速率，也與mRNA的出核過程、細(xì)胞漿定位、轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性、mRNA翻譯調(diào)節(jié)及蛋白質(zhì)的降解密切相關(guān)，蛋白質(zhì)的生物活性及功能主要通過翻譯后加工、磷酸化及蛋白酶的水解而發(fā)生[8]，基因轉(zhuǎn)錄的mRNA水平并不能完全可靠地代替其相應(yīng)蛋白質(zhì)的水平。

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編輯：吳寧

R289.53文獻(xiàn)識(shí)別碼A

1672-397X（2014）09-0071-02

雷雯（1987-），女，碩士研究生，中醫(yī)婦科學(xué)專業(yè)。

盧蘇，lusu0926@sina.com

2014-03-20