陳聲榮 呂作陪 甘艷艷

（洞頭縣人民醫(yī)院，浙江洞頭 325700）

黃芪甲苷對內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

陳聲榮 呂作陪 甘艷艷

（洞頭縣人民醫(yī)院，浙江洞頭 325700）

目的：觀察黃芪甲苷對內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）生物學(xué)功能的影響。方法：采用密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，培養(yǎng)7d后，收集貼壁細(xì)胞并隨機(jī)分為對照組及黃芪干預(yù)組（黃芪甲苷濃度分別為5、25和75μg/mL），各自干預(yù)24h后采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）、黏附能力測定試驗(yàn)、Matrigel體外成血管試驗(yàn)及Transwell小室法觀察黃芪甲苷對EPCs增殖、黏附、成血管及遷移能力的影響。結(jié)果：與對照組比較，黃芪甲苷各劑量干預(yù)組內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力、黏附細(xì)胞數(shù)、血管數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)均明顯增加。結(jié)論：黃芪甲苷可顯著提高內(nèi)皮祖細(xì)胞多種細(xì)胞生物學(xué)功能。

內(nèi)皮祖細(xì)胞 黃芪甲苷 體外實(shí)驗(yàn)

內(nèi)皮祖細(xì)胞因其獨(dú)特的促血管新生及內(nèi)膜修復(fù)作用近幾年成為研究熱點(diǎn)[1-3]。通過不同方法提高內(nèi)皮祖細(xì)胞各種生物學(xué)功能有助于其發(fā)揮促血管新生及內(nèi)膜修復(fù)作用，從而有益于動脈粥樣硬化及缺血性血管疾病的防治。黃芪臨床上用于治療心腦血管疾病，但深入的機(jī)制研究尚待開展。本研究觀察黃芪有效成分黃芪甲苷對內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，探討黃芪治療缺血性心腦血管病的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所，基質(zhì)凝膠matrigel購自美國Becton Dickson公司，Transwell小室購自美國Corning公司，胎牛血清、M199培養(yǎng)基、PBS液購自Gibco公司，人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊锕荆S芪甲苷購自上海融禾公司。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的培養(yǎng)

采用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞[2]。取健康志愿者外周血20mL，密度梯度離心，將分離的單個(gè)核細(xì)胞接種于預(yù)包被纖維連接蛋白的六孔板中，每孔加入1mL M199培養(yǎng)基[含胎牛血清（10%）、VEGF（10ng/mL），bFGF（10ng/mL）]，置37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后更換培養(yǎng)液并清洗未貼壁細(xì)胞，以后每隔3d換半液。

1.2.2 鑒定將終濃度為2.4μg/mL的DiI-ac-LDL加入預(yù)裝蓋玻片的6孔板中，與細(xì)胞避光孵育1～2h，吸棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定15min，PBS沖洗，加入FITC-UEA-I lectin（10mg/L），繼續(xù)避光孵育1h，取出蓋玻片，PBS輕洗，加抗卒滅劑后置熒光顯微鏡下拍片。

1.2.3 分組培養(yǎng)7d后，以0.25%胰酶將各孔細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，以同等數(shù)量細(xì)胞接種，隨機(jī)分為對照組與黃芪甲苷各劑量組（黃芪甲苷濃度分別為5、25、75μg/mL），培養(yǎng)24h后，進(jìn)行以下細(xì)胞生物學(xué)功能檢測。

1.2.4 增殖能力檢測用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，懸浮在500μL培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)，將等量EPC接種到包被纖維連接蛋白的96孔培養(yǎng)板，添加含10%CCK-8溶液的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4h后，置酶標(biāo)儀450nm處測OD值。

1.2.5 黏附能力檢測收集培養(yǎng)細(xì)胞，懸浮在500μL培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)，然后將同等數(shù)目的EPC接種在包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)板上，在37℃培養(yǎng)30min，PBS洗棄未貼壁細(xì)胞，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。

1.2.6 成血管能力檢測4℃溶解Matrigel膠，取50μL/孔加入96孔板中（冰上操作），37℃孵育1h成膠待用。各組細(xì)胞按10000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于鋪被有Matrigel凝膠的96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24h。取出96孔板，置于倒置顯微鏡下觀察、拍片，各組均隨機(jī)選取5個(gè)視野（×100）計(jì)數(shù)小管形成數(shù)量。

1.2.7 遷移能力檢測消化收集各組貼壁細(xì)胞，制成5×105/mL的單細(xì)胞懸液。于24孔板中放入transwell小室。下室加入600μL含10%FBS的培養(yǎng)基，上室加入100μL上述細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24h。取出transwell小室，D-Hank's液淋洗2次，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10min，0.25%結(jié)晶紫染色，各組均隨機(jī)選取5個(gè)視野（×400），計(jì)數(shù)EPCs的遷移數(shù)量。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間資料比較采用方差分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的培養(yǎng)及鑒定培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)典型的集落形態(tài)，單個(gè)六孔板中可見多個(gè)細(xì)胞集落（圖1-A）。雙熒光染色試驗(yàn)顯示細(xì)胞攝取Dil-ac-LDL且結(jié)合FITC-UEA-1 lectin：融合圖像顯示胞膜結(jié)合lectin呈綠色熒光，而胞質(zhì)的黃色熒光是吞噬ac-LDL后紅色熒光與胞膜綠色熒光融合而成（圖1-B）。

圖1 EPCs的培養(yǎng)及鑒定

2.2 黃芪甲苷對EPCs增殖黏附、成血管能力的影響見表1、圖2。與對照組比較，不同濃度黃芪甲苷干預(yù)24h后，呈濃度依賴性地提高EPCs的增殖黏附和成血管能力。

2.3 黃芪甲苷恢復(fù)EPCs受損的遷移能力與對照組比較，經(jīng)過24h黃芪甲苷干預(yù)后，EPCs遷移能力呈濃度依賴性地提高。見圖3及表1。

表1 黃芪甲苷對內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的影響（±s）

表1 黃芪甲苷對內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01。

組組別別劑量增殖能力（OD值）劑量增殖能力（OD值）血管數(shù)（個(gè)/100倍視野）對照組粘附細(xì)胞數(shù)（個(gè)/200倍視野）0.42±0.06黏附細(xì)胞數(shù)（個(gè)/200倍視野）0.42±0.06遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)/200倍視野）52.4±9.3遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)/200倍視野）52.4±9.3血管數(shù)（個(gè)/100倍視野）對照組20.4±5.830.4±7.8 20.4±5.830.4±7.8黃芪甲苷低劑量組64.1±11.1*26.3±5.2*42.8±10.2*5μg/mL0.48±0.06*黃芪甲苷中劑量組25μg/mL0.55±0.07*68.2±11.0*37.1±6.8*49.2±10.1*黃芪甲苷高劑量組75μg/mL0.69±0.09*79.6±12.3*40.9±8.1*60.5±13.2*黃芪甲苷低劑量組64.1±11.1*26.3±5.2*42.8±10.2*5μg/mL0.48±0.06*黃芪甲苷中劑量組25μg/mL0.55±0.07*68.2±11.0*37.1±6.8*49.2±10.1*黃芪甲苷高劑量組75μg/mL0.69±0.09*79.6±12.3*40.9±8.1*60.5±13.2*

圖2 黃芪甲苷對EPCs成血管能力的影響

圖3 黃芪甲苷對EPCs遷移能力的影響

3 討論

自1997年Arasaha發(fā)現(xiàn)循環(huán)中存在能促進(jìn)血管新生的的內(nèi)皮祖細(xì)胞以來[1]，有關(guān)EPCs的研究不斷深入。EPCs具有血管新生及內(nèi)膜修復(fù)兩大功效[2-3]，能響應(yīng)局部損傷與缺血，定向歸巢修復(fù)血管促進(jìn)血管新生。大量研究表明，EPCs是心血管疾病的一個(gè)生物標(biāo)志物，循環(huán)中EPCs數(shù)量及功能與心血管危險(xiǎn)相關(guān)，其數(shù)量及功能受損可導(dǎo)致血管內(nèi)皮修復(fù)功能下降，血管新生能力減弱，并加速心血管事件的進(jìn)程[4-6]。而通過不同方法提高循環(huán)EPCs數(shù)量及生物學(xué)功能將有助于心腦血管疾病的防治。因此EPCs正在成為缺血性心血管疾病的干預(yù)新靶點(diǎn)。

黃芪為臨床常用中藥，性溫，味甘，具有補(bǔ)氣固表、斂瘡生肌等功效。黃芪中的主要活性成分為黃芪多糖、黃芪皂苷及黃芪異黃酮，而黃芪皂苷中的黃芪甲苷有保護(hù)血管內(nèi)皮、抗衰老、抗氧化等作用[7-8]。本實(shí)驗(yàn)以不同濃度黃芪甲苷干預(yù)EPCs，觀察其對EPCs增殖、黏附、成血管及遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷呈濃度依賴性提高EPCs的多種細(xì)胞生物學(xué)功能，提示黃芪甲苷可能通過提高循環(huán)EPCs的數(shù)量，增強(qiáng)EPCs的血管新生能力，提高EPCs遷移至損傷內(nèi)皮并黏附修復(fù)的能力以發(fā)揮其臨床功效，這為臨床應(yīng)用黃芪治療缺血性心腦血管疾病提供了新依據(jù)。

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編輯：吳寧

R282.710.5文獻(xiàn)識別碼A

1672-397X（2014）03-0076-02

陳聲榮（1973-），男，本科學(xué)歷，主治醫(yī)師，中西醫(yī)結(jié)合臨床專業(yè)。csr654@163.com

2013-10-29