王曉明，張 帆，劉 瑩，2，張 娜，2

（1．天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室－省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193；2．天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457）

·中藥研究·

LC-MS/MS法測定升麻中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸含量的研究*

王曉明1，張 帆1，劉 瑩1，2，張 娜1，2

（1．天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室－省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193；2．天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457）

[目的]建立LC－MS/MS測定升麻藥材中3種苯丙酸類成分含量的方法。[方法]采用ACQUITY UPLC? BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）色譜柱，乙腈－0．1%甲酸水為流動相，梯度洗脫，流速為：0．3 mL/min；質譜檢測器：采用ESI電離源，負離子檢測，MRM監(jiān)測模式，對升麻藥材中苯丙酸類成分咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸進行含量測定。[結果]咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸的線性范圍分別為5～100 ng/mL，10～200 ng/mL，50～1 000 ng/mL，線性關系良好，最低定量限分別為5、10和50 ng/mL，加樣回收率97．83%～98．40%。[結論]該方法簡便，快速，精密度高，重復性好，可用于同時測定升麻中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸的含量。

LC－MS/MS；升麻；咖啡酸；阿魏酸；異阿魏酸

升麻具有發(fā)表透疹、清熱解毒、升舉陽氣的功效，主要用于風熱頭痛、齒痛、口瘡、咽喉腫痛、麻疹不透、陽毒發(fā)斑、脫肛、子宮脫垂[1－7]。升麻中主要含有機酸、三萜化合物和香豆素等化學成分，其中苯丙酸類成分主要有咖啡酸（caffeic acid）、阿魏酸（ferulic acid）和異阿魏酸（isoferulic acid）等?？Х人峋哂锌咕?、抗病毒、中樞興奮、解毒、凝血的作用；阿魏酸可抑制血小板聚集、抗血栓形成、解除血管平滑肌痙攣、改善心肌缺血、抗炎止痛、抗紫外線輻射、抗自由基以及調節(jié)人體免疫功能等；異阿魏酸具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎的作用[8－12]。

《中華人民共和國藥典》（2010年版）記載，升麻是以異阿魏酸的含量作為質控標準。雖然國內已有利用高效液相色譜法－紫外檢測器（HPLC－UV）同時測定升麻中咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸含量的文獻報道[13－14]，但該方法耗時較長，檢測靈敏度較差。為此本研究建立液質聯(lián)用/質譜（LC－MS/MS）同時測定升麻藥材中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸含量的方法，可大大節(jié)省檢測時間，且具有較高的靈敏度，可為升麻藥材的質量控制提供參考。

1 實驗試藥與儀器

1.1 試藥 甲醇（色譜純，美國Fisher Scientific公司），乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司），甲酸（色譜純，美國MREDA公司，≥96．0%），超純水（Milipore制備）。

咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸標準品（均購自中國藥品生物制品檢定所，純度＞98%），染料木素Genistein（由沈陽藥科大學提供，純度＞98%）。

升麻藥材于2013年購買于河北省安國藥材市場，經天津中醫(yī)藥大學李天祥副教授鑒定為興安升麻Cimicifuga．dahurica（Turcz．）Maxim．。

1.2 儀器 Waters Acquity UPLC－Quattro Premier XE液相色譜質譜聯(lián)用儀，MassLynx 4．1工作站，序列號：VAB1217；超純水器（Millipore公司，Mill－QⅡ型）；萬分之一天平（德國Sartorius公司，BP121S）；旋渦混合器（SCILOGEX MX－S vortexer）；高速離心機（Hettich MIKRO 220R centrifuge）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ－250E）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）；流動相：乙腈－0．1%甲酸水溶液，梯度洗脫；流速：0．3 mL/min；柱溫：50℃；進樣體積：10 μL。梯度洗脫程序見表1，各成分的色譜分離情況見圖1～2。

2.2 質譜條件 采用ESI電離源，負離子掃描，MRM檢測模式。毛細管電壓：2.8 kV；離子源溫度：120℃；去溶劑化溫度：350℃；去溶劑化氣流強度：650 L/Hr；錐體氣流強度：50 L/Hr；碰撞電壓在16～27 V。

經優(yōu)化后最終確定各化合物檢測離子對為：咖啡酸離子對178.61/134.61，阿魏酸離子對192.77/ 133.63，異阿魏酸離子對192.80/133.63，內標染料木素離子對268.73/132.53。見圖3～6。

表1 色譜梯度洗脫程序Tab.1 HPLC gradient elution program

圖1 標準品和內標色譜圖Fig.1 Standard and internal standard chromatogram

圖2 升麻藥材樣品色譜圖Fig.2 Sample chromatogram of Rhizoma Cimicifugae

圖3 咖啡酸二級質譜圖Fig.3 Fragmentation of caffeic acid

圖4 阿魏酸二級質譜圖Fig.4 Fragmentation of ferulic acid

圖5 異阿魏酸二級質譜圖Fig.5 Fragmentation of isoferulic acid

圖6 染料木素二級質譜圖Fig.6 Fragmentation of Genistein

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合標準品儲備液的配制 精密稱取咖啡酸2.0 mg、阿魏酸4.0 mg置100 mL容量瓶中，異阿魏酸5.0 mg標準品置25 mL容量瓶中，加甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶2）定容至刻度，分別配制成濃度為20、40和200 μg/mL的2種標準品儲備液。

精密移取2種標準品儲備液各10mL置100mL容量瓶中，加入甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶2）定容至刻度，得混合標準品溶液，備用。

2.3.2 內標溶液的配制 精密稱取染料木素5.0 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，混勻后稀釋，最終制成濃度為100 ng/mL的內標溶液，備用。

2.3.3 供試品溶液的配制 精密稱取升麻藥材粉末（過10目篩）0.50 g置25 mL容量瓶中，加入甲醇-0.5%甲酸水溶液（8∶2），超聲40 min，冷卻至室溫后定容。搖勻，取適量提取液，15 000 r/min離心10 min，精密移取上清液50 μL，用內標溶液稀釋20倍后進樣，測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系的考察 取“2.3.1”中混合標準品溶液逐級稀釋，得系列混合標準品溶液，精密移取各系列混合標準品溶液50 μL，準確加入“2.3.2”中的內標溶液稀釋20倍，最終配制成咖啡酸濃度為5、10、25、37.5、50、75、100 ng/mL；阿魏酸濃度為10、20、50、75、100、150、200 ng/mL；異阿魏酸濃度為50、100、250、375、500、750、1 000 ng/mL的混標溶液，渦旋，混勻，進樣。

表2 3個化合物的回歸方程和線性關系Tab.2 The calibration curves and linearity range for the three components of the assay

2.4.2 精密度與準確度 分別取低、中、高3個濃度的標準品溶液，按照“2.4.1線性關系的考察”方法進行操作，測定咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸與內標染料木素的峰面積比值，代入回歸方程，計算濃度。結果顯示：3個化合物的精密度RSD<15%，準確度偏差小于15%。

2.4.3 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的升麻藥材適量，分別加入適量的咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸與內標染料木素，平行操作6份，按照“2.3.3”項下方法進行處理與測定，以(測得值-基礎值)/加標值×100%計算回收率，結果顯示：3個化合物的回收率分別為咖啡酸98.40%、阿魏酸98.12%、異阿魏酸97.83%。

2.4.4 樣品穩(wěn)定性 取系列混標溶液樣品，于4℃條件下分別放置0、2、4、8、10、12 h，以測定樣品的穩(wěn)定性，結果顯示RSD<5%，表明樣品溶液在4℃條件下穩(wěn)定。

2.4.5 重復性考察 精密稱取同一產地升麻藥材適量，按照“2.3.3”方法操作，平行制備6份樣品，進樣，測得咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的相對標準偏差分別為0.62%，1.91%和1.38%，表明方法的重復性良好。

2.4.6 樣品含量測定 分別精密稱取不同產地升麻藥材適量，按照“2.3.3”項下的方法，每產地的藥材平行操作6份，進行樣品的含量測定。

表3 不同產地升麻藥材中3種化合物的含量(n=6)Tab.3 Contents of three compants of Rhizoma Cimicifugae from different places(n=6)mg/g

3 討論

3.1 定量指標的選擇 升麻在2010版《藥典》采用的含量測定方法是LC-UV法，且僅對異阿魏酸的含量（不得少于0．1%）有要求。鑒于咖啡酸、阿魏酸同樣具有抗炎、抗氧化等功效，也是升麻的主要活性成分，因此本實驗除了測定異阿魏酸，對咖啡酸、阿魏酸也進行了含量測定。液質聯(lián)用法雖在之前版本的《藥典》中已在附錄中收載，但直到2010年，《藥典》才正式引入正文用于川楝子、千里光等中藥中微量成分的含量測定，用以控制此類藥材的質量。升麻中阿魏酸、異阿魏酸互為同分異構體，含量相當，本實驗建立的LC-MS/MS法可有效進行升麻藥材質量的評價。

3.2 電離方式的選擇 質譜條件的優(yōu)化是通過將1 μg/mL的咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸的標準品溶液經由蠕動泵10 μL/min連續(xù)進樣，并對各質譜參數進行考察，以待測物響應值為參考。由于測定的化合物均為酚酸，易產生[M-H]-離子，所以實驗中選擇負離子方式進行掃描。通過ESI源和APCI源的比較，發(fā)現(xiàn)采用ESI源具有更高的靈敏度和專屬性，故本實驗選用ESI離子源。

3.3 流動相的選擇 由于阿魏酸和異阿魏酸互為同分異構體，色譜行為相似，實驗最初分析比較了乙腈－水與甲醇－水的分離效果，結果表明乙腈－水比甲醇－水分離效果更好。咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸均為酚酸，對pH值較敏感，故在流動相中加入適量HCOOH，以提高響應、改善峰形。在色譜條件優(yōu)化過程中，分別對比了乙腈－0．05%甲酸、乙睛－0．1%甲酸的分離效果，結果流動相為乙睛－0．1%甲酸時，阿魏酸、異阿魏酸分離最好，因此確定其為流動相。3.4 色譜柱的選擇 實驗初期選用C18（4．6 mm× 150 mm，3．5 μm）色譜柱，阿魏酸與異阿魏酸的分離效果較好，但是出峰時間過長，因而換用較短的ACQUITY UPLC?BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）色譜柱，調試液相條件，在保證分離效果的情況下，分析時間明顯縮短。

4 結論

本研究建立了LC－MS/MS測定升麻中3個苯丙酸類成分含量的方法，結果表明該方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，可用于升麻藥材的質量控制。

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LC-MS/MS determination of caffeic acid,ferulic acid acid,and isoferulic acid in Rhizoma Cimicifugae

WANG Xiao-ming1,ZHANG Fan1,LIU Ying1,2,ZHANG Na1,2
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Modern Chinese Medicine-Province and Ministry Coestablished State Key Laboratory Cultivation Base,Tianjin Key Laboratory Tianjin 300193,China;2.Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine,Tianjin,300457）

[Objective]To develop a LC－MS/MS method for simultaneous determination of caffeic acid,ferulic acid and isoferulic acid in the Rhizoma Cimicifugae．[Methods]Chromatographic separation was achieved with gradient elution by a ACQUITY UPLC?BEH C18coloum(2．1 mm×100 mm,1．7 μm)hyphenated to a mass spectrometer system was operated under the MRM mode with electrospray negative ionization．The mobile phase was acetonitrile－0．1%formic acid aqueous and the flow rate was 0．3 mL/min．[Results]Caffeic acid, ferulic acid and isoferulic acid showed good linearity in the range of 5～100 ng/mL,10～200 ng/mL,50～1 000 ng/mL．The lower limit of quantification of the 3 essential compounds was 5,10 and 50 ng/mL respectively．The average recoveries of the method were in the range of 97．83%～98．40%．[Conclusion]The method is fast,sensitive and reproducible．It can be used for the simultaneous determination of caffeic acid,ferulic acid and isoferulic acid in the Rhizoma Cimicifuga．

LC－MS/MS；Rhizoma Cimicifugae；caffeic acid；ferulic acid；isoferulic acid

R285．5

A

1672-1519（2014）11－0686－04

2014-09-09）

（本文編輯：高 杉，馬曉輝）

10．11656/j．issn．1672－1519．2014．11．13

國家自然科學基金項目（81001633，81173523，81303182），國家重大新藥創(chuàng)制項目（2012ZX09101202），國家973計劃項目（2012CB723504）。

王曉明（1982－），女，碩士，助理實驗師，從事體內藥物分析研究。