姜 晨，王佳麗，宮欣茹，張 琳，翟建新，楊洪濤

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

中藥灌腸對(duì)5/6腎切除大鼠腎衰竭模型微炎癥狀態(tài)的影響*

姜 晨1，王佳麗2，宮欣茹1，張 琳1，翟建新1，楊洪濤1

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

[目的]觀察中藥灌腸改善慢腎衰模型大鼠的微炎癥狀態(tài)情況，探討其機(jī)制。[方法]將44只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、灌腸方組和辛伐他汀組，除正除對(duì)照組外均行5/6腎切除術(shù)制作CRF動(dòng)物模型。造模后各組開始灌胃或灌腸給藥6周。分別于造模后1、3、6周取血檢測(cè)大鼠的血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、Toll樣受4（TLR4）等變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察腎臟和小腸組織形態(tài)學(xué)的改變。[結(jié)果]灌腸方組大鼠的微炎癥指標(biāo)CRP、TNF-α濃度與辛伐他汀組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明灌腸方在改善微炎癥狀態(tài)中也有類似于他汀類藥物的作用，其機(jī)制可能與阻斷TLR4表達(dá)有關(guān)。腎臟病理結(jié)果顯示灌腸治療對(duì)腎間質(zhì)纖維化有一定的改善作用。[結(jié)論]中藥灌腸能改善CRF大鼠生存狀態(tài)，延緩病情進(jìn)展，對(duì)腎間質(zhì)纖維化有一定的積極作用。其作用機(jī)制可能是通過降低炎癥因子表達(dá)，改善微炎癥狀態(tài)有關(guān)，其作用與辛伐他汀類似。

5/6腎切除；慢腎衰；微炎癥狀態(tài)；中藥灌腸；辛伐他汀

“微炎癥狀態(tài)”在慢性腎功能衰竭（CRF）進(jìn)程中十分普遍，這種以炎癥因子、急性反應(yīng)蛋白輕度持續(xù)升高為特點(diǎn)的微炎癥狀態(tài)可加重CRF患者腎功能惡化程度，而且促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）、營養(yǎng)不良、貧血等并發(fā)癥的發(fā)生，影響患者死亡率及臨床預(yù)后[1-2]。在針對(duì)微炎癥狀態(tài)的中醫(yī)治療中，灌腸療法及中藥湯劑的運(yùn)用發(fā)揮了多靶點(diǎn)治療的突出作用，已有研究證明[3]中藥能改善CKD炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和改善細(xì)胞免疫功能有關(guān)。天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科開展結(jié)腸透析并運(yùn)用灌腸方中高位保留治療慢性腎衰竭，能有效改善尿毒癥患者的臨床癥狀，延緩腎功能損害的進(jìn)程。為證實(shí)該法對(duì)“微炎癥狀態(tài)”的干預(yù)作用，筆者通過5/6腎切除大鼠腎衰竭模型，評(píng)價(jià)中藥灌腸在改善CRF大鼠“微炎癥狀態(tài)”方面的作用并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)雄性大鼠，體質(zhì)量（200± 20）g。購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 藥物 灌腸方中藥物（大黃30 g，蒲公英30 g，生牡蠣30 g）購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院煎藥室制備。辛伐他汀片：杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)130168。

1.3 儀器與試劑 BAll0S型電子天平（德國Sartorius公司）、TGL－16G低溫臺(tái)式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠制造）、全自動(dòng)生化分析儀（日本日立70209全自動(dòng)生化分析儀）、Elisa的儀器：（450±10）nm濾光片的酶標(biāo)儀、單道或多道微量加液器及吸頭、稀釋樣品的EP管等。C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、Toll樣受體4（TLR4）試劑盒：購自武漢優(yōu)爾生科技股份公司。血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、TG試劑盒均購自北京中生北控生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 分組 CRF大鼠于造模成功后隨機(jī)分為3組：1）模型組。2）灌腸方組。3）辛伐他汀組，每組12只。4）正常對(duì)照組（即假手術(shù)組）8只。

2.2 造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，依據(jù)Platt法即5/6腎切除術(shù)并按照最新的文獻(xiàn)記載[4]制備CRF大鼠模型。各組大鼠均以10%水合氯醛麻醉，常規(guī)消毒術(shù)后做背部正中直行切口，使用大鼠開口器以暴露背闊肌及腹外斜肌顯現(xiàn)腰下三角，經(jīng)此三角向上切開背闊肌，向下切開腹外斜肌，并于腰上三角處切開腰背筋膜，拉開切口，充分暴露左腎。除假手術(shù)組外，其余各組均切除左腎上下兩極約2/3，明膠海綿止血后，復(fù)位腎臟，縫合。1周后性第2次手術(shù)，結(jié)扎腎蒂，切除右腎。待創(chuàng)面凝固后，切口處放入少量磺胺粉，分別用0號(hào)、4號(hào)絲線逐層間斷縫合。術(shù)后常規(guī)注射青霉素（80 kU/只）×3 d。分別于手術(shù)后第1、3周取血測(cè)定各造模組大鼠SCr、BUN水平，以SCr水平顯著高于正常對(duì)照組為造模成功，建立CRF大鼠模型。造模前后各組大鼠SCr水平見圖1。

圖1 造模前后各組大鼠Scr水平Fig.1 The levels of Scr in rats of each group after model establishment

2.3 給藥 從造模成功后第2周開始給藥處理，1）組給予蒸餾水2 mL灌胃。2）組給予灌腸方濃煎劑2 mL，30℃左右，懸尾倒立保留灌腸1min。3）組給予辛伐他汀[5]生藥2 mL灌胃。上述各組灌藥1次/天，連續(xù)給藥6周。正常對(duì)照組不進(jìn)行任何處理，以上各組均用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水中藥灌腸方和辛伐他汀片的用量按照“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比值表”計(jì)算，每次灌胃前新鮮配制。

2.4 取材與檢驗(yàn)方法

2.4.1 取材 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（給藥6周后）大鼠隔夜空腹，測(cè)量體重，以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定大鼠暴露腹部，剪開腹部及胸廓，心臟采血約10 mL，分別注入血清管、肝素抗凝管及EDTA血常規(guī)管。肝素抗凝管2 000 r/min離心15 min、血清管5 000 r/min離心10 min，分別收集血清及血漿，400 μL/管分裝后-80℃冰箱保存，待測(cè)SCr、BUN、TG、CRP、TNF-α、TLR4等指標(biāo)。提取各組腎臟和小腸的標(biāo)本，經(jīng)過10%福爾馬林溶液固定后，石蠟包埋，做HE染色，光鏡觀察。

2.4.2 檢測(cè)方法 采用Elisa法檢測(cè)CRP、TNF-α、 TLR4的濃度變化，嚴(yán)格按照試劑盒的說明，SCr、BUN、TG檢查應(yīng)用日立公司70209全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時(shí)，若方差齊則采用LSD法，若方差不齊則采用Dunnett’T3法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 治療6周后各組血肌酐、尿素氮、甘油三酯的變化 見表1。

表1 治療后大鼠血SCr、BUN、TG情況比較（±s）Tab.1 Comparison of blood serum SCr,BUN and TG in rats after treatment（±s）

表1 治療后大鼠血SCr、BUN、TG情況比較（±s）Tab.1 Comparison of blood serum SCr,BUN and TG in rats after treatment（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；灌腸方組與辛伐他汀組比較，△P＜0.01。

組別 n SCr（μmol/L） BUN（mmol/L） TG（mmol/L）模型組 12 68．74±4．66 8．84±1．57 0．99±0．45灌腸方組 12 52．42±2．36*△8．76±1．35 0．65±0．20**辛伐他汀組 12 77．10±7．26 8．81±1．20 0．32±0．09*△

3.2 治療6周后各組CRP、TNF-α、TLR4的濃度變化 見表2。

表2 治療后大鼠血清CRP、TNF-α、TLR4的濃度比較（±s）Tab.2 Comparison of the concentration of blood serum CRP, TNF-α,and TLR4 in rats after treatment（±s）

表2 治療后大鼠血清CRP、TNF-α、TLR4的濃度比較（±s）Tab.2 Comparison of the concentration of blood serum CRP, TNF-α,and TLR4 in rats after treatment（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01，灌腸方組與辛伐他汀組比較，△△P＜0.05。

組別 n CRP（ng/mL） TNF-α（pg/mL） TLR4（ng/mL）模型組 12 12．19±1．97 30．15±0．75 12．93±1．53灌腸方組 12 08．03±0．86* 30．52±0．86 06．31±0．90*辛伐他汀組 12 07．16±1．19* 29．86±0．80 04．13±1．01*△△

3.3 各組大鼠腎臟及小腸的光鏡下病理情況比較腎臟的病理結(jié)果顯示模型組與辛伐他汀組普遍存在腎間質(zhì)纖維化，局部小片狀彌漫性炎癥，并有曲管變性或腎小球變性萎縮、蛋白管型，這可能與手術(shù)切除腎組織造成的損傷及炎癥反應(yīng)有關(guān)。灌腸方組切片的表現(xiàn)輕于其他兩組。其可能的機(jī)制是灌腸方打破了上述的循環(huán)，間接地減輕了腎小球內(nèi)的壓力，解除了引起腎小球肥大的部分因素，從而減輕了5/6腎切除大鼠的腎臟病理改變。小腸的病理切片顯示絨毛水腫，固有膜炎細(xì)胞增多，模型組、中藥組、西藥組間沒有明顯的差異改變，也提示中藥灌腸對(duì)腸黏膜沒有損傷。

4 討論

中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)于腎衰病的辨證論治中，“下法”是一類重要的治療大法。根據(jù)腎衰病本虛標(biāo)實(shí)，濁毒內(nèi)蘊(yùn)的病理性質(zhì)，針對(duì)其邪實(shí)正虛的病機(jī)，瀉邪法的運(yùn)用必不可少，臨床運(yùn)用多以通腑泄?jié)?、清熱利濕為主要的具體治法，其機(jī)理就是為了加強(qiáng)腸腑傳化功能來祛除體內(nèi)濁毒之邪。高位灌腸是治療腎衰病的外治法之一，其通過腸道的交換使?jié)岫局翱焖儆行У呐懦鲶w外，在臨床上應(yīng)用廣泛。在針對(duì)微炎癥狀態(tài)的中醫(yī)治療中，灌腸療法及中藥湯劑的運(yùn)用發(fā)揮了多靶點(diǎn)治療的突出作用，已有研究證明[3]中藥能改善CKD炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和改善細(xì)胞免疫功能有關(guān)。我院開展結(jié)腸透析中運(yùn)用灌腸方高位保留灌腸，臨床驗(yàn)證能有效的改善尿毒癥患者的臨床癥狀，降低血肌酐、尿毒氮的水平，延緩腎功能損害的進(jìn)程。既往的藥理研究[6]已發(fā)現(xiàn)大黃的抑菌作用尤為突出，對(duì)繼發(fā)于細(xì)菌性腹膜炎的麻痹性腸梗阻有治療作用，蒲公英、牡蠣提取液也有一定的抑菌作用，且針對(duì)金黃色葡萄球菌大黃酸聯(lián)合抗生素有協(xié)同作用，故針對(duì)CRF存在的微炎癥狀態(tài)可通過中藥灌腸降低炎癥因子的表達(dá)，從而緩解患者的微炎癥狀態(tài)。他汀類藥物在慢性腎臟病中的運(yùn)用已成為近幾年的研究熱點(diǎn)，在改善微炎癥和心血管事件中都存在一定的作用，能早期有效抑制炎癥反應(yīng)、降低炎癥前因子和C-反應(yīng)蛋白[7-9]，尤其是針對(duì)尿毒癥透析患者中長期存在的微炎癥狀態(tài)，早期運(yùn)用在治療中能起到一定的協(xié)同作用[10-11]；這種抑制作用可通過下調(diào)Toll樣受體4（TLR4）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)[12-13]。

本研究觀察了5/6 CRF的模型的微炎癥狀態(tài)情況，驗(yàn)證了CRF模型中微炎癥指標(biāo)的升高，且持續(xù)數(shù)周，能初步斷定慢腎衰的一種持續(xù)的微炎癥狀態(tài)的存在性，這與近期的一些實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符[1,3,14]。微炎癥狀態(tài)是一種僅表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)異常而沒有明顯的臨床癥狀的狀態(tài)，臨床中通過主要檢測(cè)血清超敏CRP和ALB來判斷。本實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)CRP和TNF-α濃度的檢測(cè)來觀察微炎癥的情況，血清TNF-α的濃度均較高，提示其在腎衰中高表達(dá)誘導(dǎo)了持續(xù)的微炎癥狀態(tài)，而本實(shí)驗(yàn)的兩種藥物干預(yù)未能有效的降低TNF-α的濃度值?？紤]可能與藥物的作用位點(diǎn)和靶點(diǎn)不同有關(guān)，可通過在基因水平上研究阻斷TNF-α高濃度的因子來開展更深入的研究。TLR4在腎臟中的意義是近年來研究的一個(gè)熱點(diǎn)問題，主要是因?yàn)樗cNF-κB的表達(dá)關(guān)系密切，NF-κB是多系統(tǒng)疾病如心臟病、糖尿病、慢性腎臟病等的一個(gè)關(guān)鍵的表達(dá)因子，所以近年來成為多學(xué)科、跨領(lǐng)域臨床與實(shí)驗(yàn)研究的焦點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中通過Elisa方法檢測(cè)了血清中TLR4的濃度水平，發(fā)現(xiàn)慢腎衰大鼠血清中的TLR4的濃度明顯高于正常組，其可能的機(jī)制與腎衰本身有關(guān)，辛伐他汀組的TLR4濃度明顯低于模型組和灌腸方組，且隨著用藥周期的延長能保持一個(gè)下降的趨勢(shì)。灌腸方組TLR4的濃度低于模型組但高于辛伐他汀組，且至6周也有一個(gè)下降的趨勢(shì)?？紤]可能與辛伐他汀阻斷了NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而抑制了TLR4的分泌有關(guān)。同時(shí)，病理結(jié)果也提示中藥灌腸對(duì)腎間質(zhì)纖維化有一定改善。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中藥灌腸治療對(duì)尿毒癥微炎癥狀態(tài)有確切干預(yù)作用，表現(xiàn)為抑制CRP與TLR4分泌，其作用機(jī)制可能與辛伐他汀類似，即阻斷NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而抑制了TLR4的分泌。

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Effect on 5/6 nephrectomy rats with micro-inflammation state treated with TCM enema

JIANG Chen1,WANG Jia-li2,GONG Xin-ru1,ZHANG Lin1,ZHAI Jianxin1,YANG Hong-tao1
（1.Department of Nephropathy,The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193, China;2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To observe effect to micro-inflammation state in experimental chronic renal failure(CRF)rats treated with TCM enema and explore it’s mechanism.[Methods]The 44 SD male rats were randomly divided into normal control group,model control group,enema group and simvastatin group.All rats were 5/6 nephrectomy surgery to become CRF animal models except normal control group.After model establishment,each group began to fill the stomach or enema for 6 weeks.The blood serum creatinine(SCr),blood urea nitrogen(BUN),triglyceride(TG),C reactive protein(CRP),transforming growth factor alpha(TNF-α),and toll like receptor 4(TLR4) were detected respectively at 1,3,6 weeks in each group,Animals were sacrificed at the end of the experiment to observe the morphological change of kidney and small intestine.[Results]The concentration of CRP and TNF-α were no statistical difference between enema group and simvastatin group.It suggested that the function of TCM enema was also similar to the role of statins in improving the micro-inflammatory state,and its mechanism may be related to blocking the expression of TLR4.Pathological results showed that enema group has a certain improving effect on renal interstitial fibrosis.[Conclusion]TCM enema can improve the CRF rat survival state,delay the progress of the disease,and have certain positive effect on renal interstitial fibrosis.The mechanism of action of TCM enema may relate to reducing inflammation factor expression,improve micro-inflammation state function.The function of TCM enema is similar to simvastatin.

5/6 nephrectomy;chronic renal failure;micro-inflammatory state;enema;simvastatin

R285.5

A

1672-1519（2014）09-0556-04

2014-03-09）

（本文編輯：馬 英，張震之）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.09.14

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 81302920）。

姜 晨（1982-），女，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，長期從事中西醫(yī)結(jié)合腎臟病工作。

楊洪濤，E-mail：tjtcmht@126.com。