羅 丁，樊小農(nóng)，趙海英，齊兆雙，石學(xué)敏

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所，天津 300193；3.國家中醫(yī)藥管理局量效關(guān)系三級實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；4.國家中醫(yī)藥管理局腦病針刺療法重點(diǎn)研究室，天津300193；5.天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

·實(shí)驗(yàn)研究·

針刺人中穴對MCAO大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的研究*

羅 丁1，樊小農(nóng)2，3，4，趙海英1，齊兆雙1，石學(xué)敏2，5

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所，天津 300193；3.國家中醫(yī)藥管理局量效關(guān)系三級實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；4.國家中醫(yī)藥管理局腦病針刺療法重點(diǎn)研究室，天津300193；5.天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

[目的]探討針刺人中穴治療缺血性腦卒中的神經(jīng)發(fā)生機(jī)制。[方法]用BrdU+/nestin+免疫熒光雙標(biāo)和蛋白免疫印跡法觀察針刺對線栓法大鼠大腦中動脈阻斷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停∕CAO）大鼠大腦新生神經(jīng)細(xì)胞及皮質(zhì)、海馬、紋狀體nestin蛋白表達(dá)量的變化的影響。[結(jié)果]針刺組MCAO大鼠BdrU+、nestin+和BrdU+/nestin+細(xì)胞數(shù)均高于正常組、假手術(shù)組和模型組（P＜0.05），模型組高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.05）；針刺組nestin在海馬和皮質(zhì)的表達(dá)量高于其他組別（P＜0.05）。[結(jié)論]缺血缺氧能引起MCAO大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，而針刺人中穴能增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用，促進(jìn)大腦功能的修復(fù)。

人中穴；MCAO；神經(jīng)干細(xì)胞；BrdU；nestin

在中國腦卒中是導(dǎo)致成年人致死致殘的主要因素，流行病學(xué)研究表明其病死率高達(dá)157個人/ 10萬，每年新發(fā)患者約250萬，有男性高于女性（1.3~ 1.5∶1）、缺血性高于出血性卒中（43%~79%∶18%~ 47%）的趨勢，給家庭和社會經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。治療腦卒中的首要目標(biāo)是提高患者的生存率和生活質(zhì)量，而傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞是永久細(xì)胞，腦卒中時神經(jīng)細(xì)胞損傷為不可逆損傷。石學(xué)敏院士創(chuàng)立的醒腦開竅針刺法對卒中后患者神經(jīng)功能恢復(fù)有很好的效果，但腦內(nèi)機(jī)制尚不明確，因此本研究以針刺人中穴（醒腦開竅針刺法主穴）為切入點(diǎn)，用BrdU/ nestin熒光雙標(biāo)和蛋白免疫印跡的方法，觀察大鼠大腦中動脈阻斷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停∕CAO）新生神經(jīng)細(xì)胞及鼠腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體nestin蛋白表達(dá)量變化，探討針刺治療缺血性腦卒中的神經(jīng)發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 水合氯醛、無水乙醇、二甲苯、濃鹽酸（天津化學(xué)試劑廠），4%多聚甲醛溶液（武漢博士德公司），石蠟（上海華永公司），BrdU（Sigma公司），兔抗大鼠Nestin多克隆抗體（Abcom公司），小鼠抗大鼠Brdu單克隆抗體（Millipore Chemicon公司），山羊抗小鼠IgG綠色熒光二抗、山羊抗兔IgG紅色熒光二抗山羊封閉血清工作（上海麥約爾公司），多聚賴氨酸防脫片（北京中杉金橋公司），Bis、Tris、APS、SDS、EDTA、NP-40，Tritonx-100、PMSF、TEMED、異丙醇、BCA kit、GelBlotPapers雜交濾紙，溴酚藍(lán)，BCA蛋白定量試劑盒，裂解液，甘油，β-巰基乙醇，PVDF膜（均購于上海生工）。marker(10-250kDa，F(xiàn)ermentas，#SM1811)，顯影液，內(nèi)參（βactin）二抗（羊抗兔），Nestin山羊抗小鼠HRP標(biāo)記抗體均購自MILLPORE公司，內(nèi)參（β-actin）一抗（ 兔 抗 鼠 ，CellSignaling，#4970），Anti-Nestin Monoclonal Antibody購自Thermo公司。

1.1.2 主要儀器 LEICATP1200脫水機(jī)、LEICAEG1150H包埋機(jī)、LEICAEG1150C冰臺、LEICARM2245切片機(jī)、熒光顯微鏡（德國LEICA）；CS-VI型攤片烤片機(jī)、TS-1型脫色搖床、HH-W三用恒溫水箱、BT-100恒流泵，電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽（北京六一廠），BioRad凝膠成像系統(tǒng)（BioRad公司），移液器（Eppendorf），Olympus數(shù)碼相機(jī)（以上均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組 SPF級Wistar成年健康雄性大鼠40只（260~280 g，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院），按隨機(jī)數(shù)字表分為正常組、假手術(shù)組、模型組和針刺組（n=10）。實(shí)驗(yàn)操作獲天津中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，所有動物均遵循相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備與干預(yù)方法 參照Zea-Longa線栓法制備大鼠MCAO模型[2]，大鼠造模清醒后，按Zausinger[3]六分法評定造模成功與否，排除造模后病情過輕或過重的模型（評分為0、4和5分的大鼠）。針刺組大鼠在造模成功清醒后，予針刺人中穴（大鼠鼻中隔下方約1 mm[4]）干預(yù)，刺激參數(shù)為頻率180次/分，持續(xù)刺激5 s，每12 h一次，持續(xù)7 d。假手術(shù)組：除不插入魚線外操作與手術(shù)組相同，并與針刺組相同次數(shù)捉抓。

1.3.2 標(biāo)本取材與制備 每組10只大鼠中，5只用于熒光雙標(biāo)記、5只用于免疫沉淀檢測大腦海馬、皮質(zhì)和紋狀體各部nestin蛋白含量。用于檢測熒光雙標(biāo)記的大鼠于造模24 h后腹腔注射給予BrdU（50 mg/kg），每12 h一次，連續(xù)6 d，7 d后4%多聚甲醛灌注取腦固定，24 h后在大腦冠狀位視交叉處切厚約3 mm腦組織切片，依次置于70%、80%、90%、95%、100%乙醇和二甲苯、石蠟中脫水，包埋機(jī)中包埋后切成4μm片，用多聚賴氨酸處理的防脫片撈起置于60℃烘片機(jī)上烘干備用。用于免疫蛋白質(zhì)印跡法檢測的大鼠斷頭后取腦冷凍備用。

1.3.3 免疫熒光雙標(biāo)記法 70℃烤片2 h，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟透明水化組織切片，0.01 mmol/L PBS沖洗3次，檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）微波爐中火5 min兩次進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫下冷卻60 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次后在2 mol/L HCl 37℃中解旋30 min，PBS漂洗后用10%山羊血清室溫封閉30min，加Brdu 1∶50、Nestin 1∶100一抗混合液4℃孵育過夜，室溫復(fù)溫45 min后加山羊抗小鼠（1∶300）、山羊抗兔（1∶300）避光孵育4 h，75%甘油封片，熒光顯微鏡觀察拍攝，記錄400倍下每個視野中陽性細(xì)胞的數(shù)量。

1.3.4 免疫蛋白質(zhì)印跡法 用蛋白酶抑制劑和裂解液（1:50）提取各組海馬、皮質(zhì)、紋狀體的總蛋白，分裝于-80℃冰箱中保存，用BCA蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量，定量后的蛋白樣品分別經(jīng)8%和10%聚丙烯酰胺凝膠（均用丙烯酰胺、tris、SDS、APS、TEMED制備）20 mA電泳。在傳膜槽中轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入5%牛奶封閉液中封閉1 h，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）漂洗3次后加3 mL一抗小鼠抗大鼠（1∶3 000）密封4℃過夜，漂洗后加二抗羊抗鼠HRP（1∶4 000）室溫中搖動反應(yīng),加化學(xué)發(fā)光檢測試劑，用Biorad凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS18.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布計(jì)量資料的組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布計(jì)量資料的組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 針刺對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響 免疫熒光雙標(biāo)記法觀察各組大鼠腦片，正常組和假手術(shù)未見免疫陽性細(xì)胞，模型組和針刺組可見免疫陽性細(xì)胞，主要分布于缺血皮質(zhì)及紋狀體、半暗帶周圍，其中針刺組陽性細(xì)胞數(shù)高于模型組，表明缺血缺氧能誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，而針刺人中穴能增強(qiáng)缺血缺氧后神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用（見表1、圖1）。

表1 針刺對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effect of acupuncture on the proliferation of neural stem cells（±s） 個/視野

表1 針刺對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effect of acupuncture on the proliferation of neural stem cells（±s） 個/視野

注：與正常組相比，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組相比，○P＜0.05；與針刺組相比，☆P＜0.05。

組別 n BrdU+nestin+BrdU+/nestin+正常組 5 0○☆0○☆0假手術(shù)組5 0○☆0○☆0模型組 5 8.80±1.30*#☆4.60±0.89*#☆0針刺組 5 26.20±6.76*#○10.40±1.14*#○2

2.2 針刺對大鼠海馬、皮質(zhì)、紋狀體nestin蛋白表達(dá)的影響 7 d后，模型組、針刺組大鼠海馬、皮質(zhì)的nestin表達(dá)蛋白均增加（P＜0.05），紋狀體雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但也表現(xiàn)出了增加的趨勢，說明缺血能誘導(dǎo)大腦nestin蛋白的表達(dá)，而針刺能增強(qiáng)nestin蛋白的表達(dá)（見表2）。

表2 針刺對大鼠海馬、皮質(zhì)、紋狀體nestin蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.2 Effects of acupuncture on the expression of nestin protein in cortex,hippocampus and striatum（±s）bit

表2 針刺對大鼠海馬、皮質(zhì)、紋狀體nestin蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.2 Effects of acupuncture on the expression of nestin protein in cortex,hippocampus and striatum（±s）bit

注：與正常組相比，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組相比，○P＜0.05；與針刺組相比，☆P＜0.05。

組別 n 海馬 皮質(zhì) 紋狀體正常組 5 01.62±0.58 1.56±0.55 1.39±0.29假手術(shù)組 5 01.44±0.87 1.81±1.09 1.34±0.47模型組 5 07.32±12.92*#☆2.75±1.36*#2.07±2.25針刺組 5 15.61±23.50*#○4.67±1.20*#2.84±2.19

圖1 針刺對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effect of acupuncture on the proliferation of neural stem cells

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞是存在于成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)、具有增殖和分化功能的一類細(xì)胞[5]，缺血性腦卒中能誘發(fā)腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化與轉(zhuǎn)移[6-7]，從而實(shí)現(xiàn)大腦的自我修復(fù)，減少缺血缺氧造成的損害，使治療腦卒中后神經(jīng)功能損傷成為可能。研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞在正常鼠腦中主要以靜息的狀態(tài)存在于室管膜下層（SVZ）[8]和海馬齒狀回區(qū)（DG）[9]，這些內(nèi)源性的NSCs在一定條件下如缺血缺氧、外傷等，可被激活、并分化為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，參與新神經(jīng)功能環(huán)路形成，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

BrdU是胸腺嘧啶脫氧核苷的類似物，因其能在S期進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)參與細(xì)胞分裂多用于標(biāo)記包括神經(jīng)細(xì)胞、少突神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等在內(nèi)的各種新生細(xì)胞。nestin是在廣泛存在于胚胎期神經(jīng)細(xì)胞中、并在哺乳動物中樞神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中一過性表達(dá)的特異性第Ⅵ類中間絲蛋白，是神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志性抗原，多用于監(jiān)測神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況。

醒腦開竅針刺法是經(jīng)過幾十年臨床應(yīng)用、已證明了的對缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能與生活質(zhì)量有較好療效的治療方案[10]。筆者的前期研究表明，醒腦開竅針刺法能通過上調(diào)c-fos[11]和CaN[12]基因的表達(dá)，建立腦梗死后的側(cè)枝循環(huán)[13]，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞Ca2+[14]超載，改善局部微循環(huán)[15]和維持缺血后正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量[16-17]，從而實(shí)現(xiàn)MCAO大鼠行為學(xué)、梗死率等指標(biāo)的改善[18]。本研究中，通過對神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量和MCAO鼠大腦海馬、皮質(zhì)、紋狀體的nestin蛋白表達(dá)量的觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)MCAO造模后的模型組、針刺組無論在BrdU+、nestin+，還是nestin蛋白表達(dá)量上，均高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.05），表明大腦中動脈阻塞造成的缺血缺氧可誘導(dǎo)成年鼠大腦中的NSCs的增殖，這與國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果[6,19-21]一致，而針刺組上述指標(biāo)的表達(dá)又高于正常組、假手術(shù)組和模型組（P＜0.05），表明針刺人中穴能促進(jìn)缺血皮質(zhì)及海馬、半暗帶周圍NSCs的增殖，增殖的膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞對MCAO后神經(jīng)發(fā)生有正性調(diào)節(jié)的作用。故醒腦開竅針刺法治療缺血性腦卒中獲效的機(jī)制可能與人中穴促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化和成活，以維持正?！肮ぷ鳌钡纳窠?jīng)元數(shù)量有關(guān)。

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Study on the effect of acupuncturing Renzhong on proliferation of neural stem cells in central nervous system of MCAO rat

LUO Ding1,FAN Xiao-nong2,3,4,ZHAO Hai-ying1,QI Zhao-shuang1,SHI Xue-min2,5
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.The Acupuncture and Moxibustion Institute of the First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;3.Three-level Laboratory of dose-effect relationship of the State Administration of TCM,Tianjin 300193,China;4.Tianjin Acupuncture Key Laboratory of the State Administration of TCM,Tianjin 300193,China;5.Acupuncture Encephalopathy Key Research Laboratory of the State Administration of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To discuss the mechanism of treating ischemic stroke by acupuncturing Renzhong.[Methods]We observed the population of BrdU+/nestin+cells and expression of nestin protein in cortex,hippocampal and striatum in MCAO rat by double-labeling immunofluorescence and Western blot.[Results]Renzhong group’s population of BdrU+,nestin+and BrdU+/nestin+cells were significant higher than that in normal group,sham group and control group in brain of MCAO rat（P＜0.05）.Renzhong group also had the highest expression of nestin protein in cortex and hippocampal（P＜0.05）.[Conclusion]Acupuncture of Renzhong can enhance the proliferation of NSCs in central nervous system of MCAO rat.

Renzhong；MCAO；NSCs；BrdU；nestin

R223.11

A

1672-1519（2014）09-0548-04

2014-03-18）

（本文編輯：馬 英，張震之）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.09.12

國家重點(diǎn)研究計(jì)劃（973）項(xiàng)目（2010CB530506）；天津市科委項(xiàng)目（10JCBJC12700）。

羅 丁（1985-），女，博士研究生，研究方向?yàn)獒槾讨委熌X卒中的機(jī)制研究。

樊小農(nóng)，E-mail：fanxiaonong@163.com。