張盼盼王 麗阿地力江·伊明**劉鳳霞迪麗達(dá)爾·庫德熱提

1. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（烏魯木齊 830011）;

2. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)臨床2012-2班，3. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室

·論 著·

雌性大鼠交配實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?

張盼盼1王 麗2阿地力江·伊明1**劉鳳霞1迪麗達(dá)爾·庫德熱提3

1. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（烏魯木齊 830011）;

2. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)臨床2012-2班，3. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室

目的建立最佳雌性大鼠交配實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。方法正常雌性SD大鼠30只，隨機(jī)分為自然組、黃體酮組和去勢+藥物組，每組10只。自然組大鼠不給于任何處理；黃體酮組于交配前4h僅注射黃體酮500μg/只；去勢+藥物組統(tǒng)一行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，于交配實(shí)驗(yàn)前48h和4h分別皮下注射苯甲酸雌二醇20μg/只和黃體酮500μg/只。各組于交配前進(jìn)行陰道涂片，并正常雄鼠進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)，檢測其交配成功率。結(jié)果自然組1 只大鼠發(fā)情，交配成功率10%；黃體酮組2只大鼠發(fā)情，交配成功率20%；去勢+藥物組陰道涂片顯示全部處于發(fā)情期，交配成功率為100%。結(jié)論 雄鼠的性行為與雌鼠是否發(fā)情密切相關(guān)，在性行為學(xué)檢測中，經(jīng)雌孕激素處理的去勢雌鼠為最佳交配實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

卵巢切除術(shù); 大鼠; 交配; 模型

近年來，隨著生活節(jié)奏加快，壓力增大，男性勃起功能障礙（Erectile dysfunction, ED）的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。有資料顯示，在世界范圍內(nèi)，1995年ED患者達(dá)1.52億，在40 ～70歲的男性中，約有52%的男性有不同程度的ED，預(yù)計(jì)到2025年將會(huì)上升至3.22億人[1]。因此，ED的研究成為社會(huì)的需要，而雄性動(dòng)物的性行為學(xué)檢測是ED研究的重要組成部分，規(guī)范的性行為學(xué)實(shí)驗(yàn)則尤為重要。本文對用于交配實(shí)驗(yàn)的幾種可能的雌鼠模型進(jìn)行比較研究，以確立最佳模型，為性行為學(xué)實(shí)驗(yàn)提供良好的工具。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡清潔級雌性SD大鼠30只，雄性SD大鼠10只，平均體質(zhì)量（200±30）g，新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。大鼠自由飲食水，給予規(guī)律光照（12/12h），室內(nèi)相對濕度40%～60%，室溫（22±2）℃。

二、主要試劑、藥物及設(shè)備器械

苯甲酸雌二醇注射液2mg/mL（寧波三生藥業(yè)有限公司），黃體酮注射液20mg/mL（ 浙江仙琚制藥股份有限公司），瑞氏-姬姆薩染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），顯微成相系統(tǒng)（德國leica公司），常規(guī)手術(shù)器械一套。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

30只雌性大鼠隨機(jī)分為自然組、黃體酮組和去勢+藥物組，每組10只。

（二）去勢組卵巢切除方法

手術(shù)器械常規(guī)消毒，大鼠以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（35mg/kg）。仰臥位，剪除背部手術(shù)區(qū)毛發(fā)，常規(guī)消毒，以最后一肋和兩大腿根部連線中點(diǎn)為中心切一約1cm的縱行切口，暴露肌肉層，剪一約0.6cm的縱行切口，在切口深面可看到白色脂肪團(tuán)，用組織鑷將脂肪團(tuán)拖出，可看到在脂肪團(tuán)的中央有一灰紅色、直徑約0.5cm、表面有不規(guī)則結(jié)節(jié)的卵巢，結(jié)扎并切除卵巢后縫合。用同樣的方法切除右側(cè)卵巢（見圖1）。術(shù)后切口碘伏消毒，肌注青霉素20萬U/ kg?d-1，連續(xù)3d，休息2周，注意保溫。

圖1 卵巢去勢過程

（三）激素藥物注射

黃體酮組于交配前4h僅注射黃體酮（progesterone）500μg/ 只；去勢+藥物組于交配實(shí)驗(yàn)前48h和4h皮下注射苯甲酸雌二醇（estradiol benzoate） 20μg/只和黃體酮500μg/只；自然組不給予任何處理。

（四）陰道涂片的制備

3組大鼠于交配實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行陰道涂片。將蘸有生理鹽水的自制棉簽插入雌鼠陰道內(nèi)旋轉(zhuǎn)一圈，抽出棉簽并在載玻片上滾一圈，涂片用95%酒精固定，待酒精干燥后，采用瑞氏-姬姆薩染液進(jìn)行染色并鏡檢。

（五）雄鼠篩選實(shí)驗(yàn)

在交配實(shí)驗(yàn)正式開始前1周，對雄鼠進(jìn)行篩選，只將有交配能力的雄鼠納入實(shí)驗(yàn)。

（六）交配實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排在晚上19：00～20：00，保持室內(nèi)安靜，調(diào)暗光線至剛好可以看清為止，將雄鼠放入觀察籠，適應(yīng)10min后，將雌鼠輕輕放入籠中，雌雄比例2:1，觀察并記錄其在30min內(nèi)的交配行為。

（七）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、雌鼠去勢結(jié)果

雌鼠去勢后均在1h內(nèi)蘇醒，傷口無感染、滲血情況。1周后進(jìn)行陰道涂片，連續(xù)5d，無動(dòng)情周期變化。

二、陰道涂片結(jié)果

去勢+藥物組注射上述激素藥物后，交配前陰道涂片顯示均處于發(fā)情期，黃體酮組注射黃體酮后僅有2只大鼠處于發(fā)情期，自然組僅1只大鼠處于發(fā)情期，見表1。處于發(fā)情前期大鼠的陰道涂片中，以有核的圓形上皮細(xì)胞為主；處于發(fā)情期大鼠的陰道涂片中，上皮細(xì)胞成熟，脫落，變成角質(zhì)細(xì)胞，主要為無核多邊形細(xì)胞；發(fā)情后期的涂片中則白細(xì)胞出現(xiàn)，到了發(fā)情間期白細(xì)胞大量出現(xiàn)，還伴有少量的上皮細(xì)胞和角化細(xì)胞。各發(fā)情周期陰道涂片，見圖2。

表1 3組陰道涂片大鼠發(fā)情結(jié)果比較（只）

三、交配實(shí)驗(yàn)結(jié)果

處于發(fā)情期的雌鼠均成功交配，其余雌鼠則拒絕交配（見表2）。雄鼠交配過程包括嗅舔、爬背、插入、射精一系列行為（見圖3）。若雌鼠發(fā)情狀態(tài)良好，當(dāng)雄鼠靠近會(huì)出現(xiàn)“角弓反張”動(dòng)作，即雌鼠脊柱向下彎成弓形，頸部昂起，臀部翹起，同時(shí)雙耳高頻震顫，并伴有迅速而短暫的跳躍動(dòng)作。當(dāng)雌鼠處于非發(fā)情期時(shí)，會(huì)拒絕雄鼠的一系列性行為，例如當(dāng)雄鼠嗅舔雌鼠會(huì)陰區(qū)時(shí)，雌鼠會(huì)用后腿蹬踹雄鼠；當(dāng)雄鼠爬背時(shí)，雌鼠會(huì)翻過身來反抗，甚至撕咬。若雄鼠足夠強(qiáng)壯，也可發(fā)生插入，但交配成功率較低。

表2 交配結(jié)果

圖2 大鼠發(fā)情周期陰道涂片（20×10）倍

A: 嗅舔; B: 爬背; C: 插入; D: 射精

討 論

雌鼠只在發(fā)情期的數(shù)小時(shí)內(nèi)允許雄鼠交配。雌鼠的發(fā)情不受季節(jié)溫度的影響，具有多發(fā)性、周期性的變化規(guī)律。大鼠性周期為4～5d，在此周期內(nèi)，生殖系統(tǒng)發(fā)生一系列組織學(xué)的變化，可作陰道涂片檢查[2]。目前，國內(nèi)外研究雄性性行為的方法各異，國內(nèi)有學(xué)者對雌鼠每天進(jìn)行陰道涂片，檢查處于動(dòng)情期的雌鼠用來和雄鼠交配，以此來對雄性性行為學(xué)進(jìn)行相關(guān)研究[3]，但該方法很難保證多只雌鼠同時(shí)處于發(fā)情狀態(tài)，并容易造成雌鼠陰道感染，且涂片過程對雌鼠也是一種外源性刺激，易干擾其生理周期。另有學(xué)者[4]直接將雄鼠與未交配過的成年雌性大鼠進(jìn)行合籠，第一周僅有1/3～1/2完成交配。我們通過比較自然組、黃體酮組和去勢+藥物組大鼠的交配成功率，最終確定經(jīng)雌孕激素處理的去勢雌鼠與雄鼠進(jìn)行交配，成功率最高，此法可在同一時(shí)間內(nèi)獲得多只發(fā)情狀態(tài)良好的雌鼠。由于雄性的性行為主要由雌鼠的引誘而激發(fā)的，所以，本模型不僅可以用于研究各類因素引法的雄性大鼠性行為的改變、性功能障礙以及藥效評價(jià)，還可利用該模型研究性的激發(fā)與調(diào)控機(jī)制等。

在雌鼠發(fā)情前期，雌激素分泌開始升高，但血液中雌激素含量還較低，所以陰道上皮細(xì)胞增殖速度緩慢，脫落到陰道中的細(xì)胞較小，常呈橢圓形或近圓形的有核細(xì)胞[5]。發(fā)情期，血液中的雌激素含量達(dá)到高峰， 雌激素可刺激陰道上皮增厚，上皮細(xì)胞迅速發(fā)育，體積變得大而扁平，常呈大方塊、多邊形，有鈍角，易于脫落[6]。在雌激素的作用下，上皮細(xì)胞合成和聚集大量的糖原，隨表層細(xì)胞的脫落，糖原在陰道桿菌作用下分解成乳酸，使陰道保持酸性，可防止病菌的入侵[5]。發(fā)情間期，雌激素含量很低，孕酮含量較高，角質(zhì)化上皮細(xì)胞很少，上皮變薄，白細(xì)胞浸潤，防止由于糖原減少而引起的微生物繁殖感染。這時(shí)陰道涂片就以白細(xì)胞為主。發(fā)情后期僅是發(fā)情期向發(fā)情間期的過渡，所以3 種細(xì)胞均有[7]。

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)雌孕激素處理的去勢大鼠陰道涂片均顯示為發(fā)情期，在稍后的交配實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)典型的發(fā)情現(xiàn)象，如角弓反張、雙耳高頻震顫等，且交配成功率為100%，說明此模型為性行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中的首選模型；而黃體酮組大鼠在卵巢存在的情況下，外源性給予孕激素，結(jié)果顯示并不能促使其都處于發(fā)情狀態(tài)，原因可能與血液中雌激素的含量相關(guān)，說明孕激素必須在雌激素的作用下才能發(fā)揮催情效應(yīng)；自然組大鼠不做任何處理直接進(jìn)行陰道涂片并交配，結(jié)果顯示僅一只大鼠處于發(fā)情期且交配成功，進(jìn)一步證實(shí)了雄鼠的交配成功率與雌鼠發(fā)情狀態(tài)有著直接的必然聯(lián)系。

1 Ayta IA, Mekinlay JB, Krane RJ. The likely worldwide increase in erectile dysfunction between 1995 and 2025 and some possible policy consequences.BJU Int1999; 84(1): 50-56

2 施新猷. 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué). 北京: 人民軍醫(yī)出版, 1999: 331

3 吳水生, 張文光, 鄭良樸, 等. 交配頻率對雄性大鼠血清一氧化氮水平的影響. 中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué) 2005, 14(5): 400

4 周激文, 李文琦, 潘汝能, 等. TH5對雄性大鼠性行為與血清性激素水平影響的研究. 標(biāo)記免疫分析與臨床2000; 7(2): 81-83

5 南京醫(yī)學(xué)院, 浙江醫(yī)科大學(xué), 上海第二醫(yī)科大學(xué), 組織胚胎學(xué)(第3版). 江蘇: 科學(xué)技術(shù)出版社, 1990 : 176-177

6 Chateau D, Geiger J M, Samama B,et al.Vaginal keratinization during the estrous cycle in rats: a model for evaluating retinoid activity.Skin Pharmacol1996; 9(1): 9-16

7 李雨珊, 李斌, 馬立會(huì), 等. 發(fā)情雌鼠鑒定對交配成功率的影響. 中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志 2011; 13(11): 5-7

（2014-04-28收稿）

The establishment of female rats mating model*

Zhang Panpan1, Wang Li2, Adilijiang Yiming1**, Liu Fengxia1, Dilidaer Kudereti3
1. Department of Human Anatomy, Collge of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011,China;
2. Traditional Chinese and Clinical Medicine 2012-2; College of Traditional Chinese MedicineXinjiang Medical University; 3. Department of Microbiology; Collge of Basic Medicine; Xinjiang Medical University

Adilijiang Yiming, E-mail: adljym@163.com

ObjectiveTo establish the best female rats mating model.MethodsTotal of 30 normal female SD rats were randomly divided into three groups including the natural group(10 rats), the progesterone group(10 rats) and the castration group(rats). Rats in the progesterone group were injected with 500 ug progesterone at 4h before the mating test. Rats in the castration group whose underwent bilateral ovariectomized were injected with 20μg estradiol benzoate and 500ug progesterone at 48h and 4h respectively before mating. Rats in the natural group were as the control. Vaginal smear was performed before mating test, and then the mating test was done.ResultsOnly 1 rat was in estrus in the natural group, successful mating rate of this group was 10%; Two rats of progesterone group were in estrus, and the successful rate was 20%; rats of castration group were all in estrus, and the successful rate was 100%.ConclusionMale sexual behavior was closely related to female estrus. Hormone-treated females castration rats were the best animal mating models.

ovariectomy; rats; copulation; models

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.002

R-332

資助: 國家自然科學(xué)基金（81160470，81260581）; 新疆醫(yī)科大學(xué)校內(nèi)支撐學(xué)科項(xiàng)目（XYDXK50780307)
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, E-mail: adljym@163.com