孫寶剛 王麗霞 曹井賀 梁魯南 楊愛軍 王雪楠 牛煥付

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（濟(jì)寧 272000）

精子-卵子細(xì)胞相互作用檢測與IVF結(jié)局的相關(guān)性研究*

孫寶剛 王麗霞 曹井賀 梁魯南 楊愛軍 王雪楠 牛煥付

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（濟(jì)寧 272000）

目的研究男性不育患者的精子功能；探討精卵結(jié)合檢測在體外受精、胚胎移植術(shù)（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）助孕中的應(yīng)用價(jià)值。方法 收集在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科就診并行IVF治療的89例男方患者，根據(jù)不孕不育原因分為男性不育組（A組）44例和完全女方因素引起的不孕不育組（B組）45例，將A組隨機(jī)分為A1組和A2組各22例分別行IVF-ET與卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）受精，將A1組受精率小于30%的行早期補(bǔ)救。將兩組男方的精子利用廢卵分別進(jìn)行精卵結(jié)合實(shí)驗(yàn)和透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。觀察A組與B組平均精卵結(jié)合數(shù)和透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)情況，比較分析兩組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及臨床妊娠率的差別，分析透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率與受精率的關(guān)系。結(jié)果A組平均精卵結(jié)合數(shù)（65.84±10.27）和透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率[（43.87±17.65）% ]明顯低于B組的平均精卵結(jié)合數(shù)（89.93±8.73）及透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率[（79.48±14.45）% ]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A1組的受精率（43.37%）明顯低于B組（73.21%）和A2組（66.19%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而經(jīng)補(bǔ)救ICSI后A1組受精率為63.36%，與B組和A2組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A1組的優(yōu)胚率（41.35%），與A2組（50.74%）及B組的優(yōu)胚率（58.11%）相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0. 05）；A2組的受精率及優(yōu)胚率與B組比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A組的妊娠率（43.18%）與B組（48.89%）相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A1組的受精率與透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率具有明顯的相關(guān)性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.889，P＜0.01）。結(jié)論精卵結(jié)合及透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)是有重要意義的精子功能檢測實(shí)驗(yàn)。開展精卵結(jié)合試驗(yàn)以及透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)試驗(yàn)?zāi)軌蚋玫念A(yù)測精子的受精能力，為臨床治療提供更有價(jià)值的信息。早期補(bǔ)救ICSI可以有效避免完全不受精或低受精率的情況，可以顯著改善實(shí)驗(yàn)室及臨床結(jié)局。

不育, 男性; 頂體反應(yīng); 精子注射, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi); 受精, 體外

目前，全球約10%～15%的育齡夫婦有生育障礙，其中男性因素占30%～50%[l]，目前，大多數(shù)的生殖中心主要通過常規(guī)的精液分析結(jié)果來判斷患者，從而選擇IVF還是ICSI治療。然而精液的常規(guī)分析僅僅能夠測定精子的密度，活動(dòng)率及其形態(tài)，并不能準(zhǔn)確的反映出其他的功能，像精卵結(jié)合能力和透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)能力等。

一般而言，對于精液參數(shù)嚴(yán)重異常的夫婦，我們通過ICSI治療；對于精子參數(shù)輕度異常的夫婦，在進(jìn)行常規(guī)的IVF治療時(shí)會(huì)有10%～20%完全受精失敗或低受精（受精率＜30%）情況發(fā)生，有研究顯示在IVF受精失敗的病人中，約有70%病例是由于精子與透明帶結(jié)合障礙所引起[2]。因此，用精子與透明帶結(jié)合試驗(yàn)來預(yù)測精子受精能力具有很大的臨床意義，可以幫助選擇IVF或ICSI治療病人，以期獲得良好的妊娠結(jié)局[3]。

對象與方法

一、研究對象

收集在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科就診并行IVF治療的男方精液，根據(jù)不孕不育原因分為完全男方因素引起的不孕不育組（A組）（精子濃度≤15 ×106/mL，總活力為[前向運(yùn)動(dòng)（PR）+非前向動(dòng)動(dòng)（NP）]＜40%或PR＜32%；精子總數(shù)≤39×106/次；精子畸形率＜96%（按《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊》第5版，正常精子形態(tài)百分比＜4%）。和完全女方因素引起的不孕不育組（B組）（女性不孕因素有輸卵管因素（其通過HSG或者宮腔鏡、腹腔鏡手術(shù)以及超聲檢查證實(shí)）。

二、方法

（一）控制性超促排卵

實(shí)驗(yàn)組與對照組女方均選擇長方案超促排卵于前次月經(jīng)黃體中期肌注促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（gonadotropin-releasing hormone agonist, GnRH-a）0.03～0.1mg，月經(jīng)第3天開始使用促性腺激素（gonadotropin, Gn）150～225 IU 共5d促排卵，月經(jīng)第5天起，行陰道B超檢查卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，并以此及時(shí)調(diào)整用藥。直至有2～3個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑在18mm以上時(shí)，結(jié)合激素檢測結(jié)果提示卵泡發(fā)育成熟，停用促排卵藥物，于當(dāng)日注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic,gonadotropin, HCG）5 000～10 000u。注射HCG后34～36h在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵，記錄取卵數(shù)。

（二）精子處理

將實(shí)驗(yàn)組與對照組的男性精液標(biāo)本采用密度梯度分離法分離：其具體步驟為：取精子密度梯度分離培養(yǎng)基，吸取1ml下層（高密度）分離培養(yǎng)基置于離心管中，再吸取1ml上層分離培養(yǎng)基（低密度）緩慢地注于下層分離培養(yǎng)基的上面．兩層培養(yǎng)基的中間形成一個(gè)清晰的界面，37℃培養(yǎng)箱復(fù)溫。小心吸取1ml培養(yǎng)基化的精液覆蓋于上層分離培養(yǎng)基的液面。以（300～600）×g的速度離心20min。移去所有的分層溶液，只剩底部的沉淀。加2～3ml洗精培養(yǎng)基，將沉淀混勻。200×g離心5min。移去上清，再加入洗精培養(yǎng)基，重復(fù)離心洗滌步驟。用0.5ml IVF受精培養(yǎng)基懸沉淀。進(jìn)行精于計(jì)數(shù)和精子質(zhì)量評估。將處理獲得的精子調(diào)整密度（50～300）×103/mL為宜，后置5%CO2、37℃、95%濕度培養(yǎng)箱待用。

（三）卵子來源

本實(shí)驗(yàn)所有卵子來源于我院生殖中心ICSI治療受精失敗的患者的卵子，或者我們采用的卵子包括待成熟受抑制狀態(tài)的生發(fā)泡（Germinalvesicle，GV）和MI（第一次減數(shù)分裂中期）卵母細(xì)胞期的未成熟卵?；颊叩哪挲g小于35歲，不孕的原因明確為輸卵管因素或男性因素。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，并與患者簽訂科研捐贈(zèng)知情同意書。

（四）精子與透明帶結(jié)合試驗(yàn)

通過密度梯度離心法處理后的含有20%血清代用品及HTF液體精子溶液lml，與隨機(jī)取出的4個(gè)卵子加入放人含有胚胎培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后放入5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)2h。2h后將卵子轉(zhuǎn)移至含有2mg/mL的牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖溶液的培養(yǎng)皿中，然后用稍大于卵子兩倍直徑的巴氏特吸管反復(fù)吹打卵子數(shù)次以去除未與卵子結(jié)合的精子，正常生育力男子精子，每個(gè)卵子平均有上百個(gè)精子結(jié)合在透明帶上。最后在相差顯微鏡下計(jì)數(shù)結(jié)合在卵子透明帶上的精子數(shù)量，見圖1A。

（五）透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)試驗(yàn)

用略小卵子直徑的巴氏特吸管反復(fù)吹打精子與透明帶結(jié)合試驗(yàn)卵子，使之與卵子結(jié)合的精子能從卵子脫落下來。考馬斯亮藍(lán)（coomassie brilliant blue, CBB）R250（Sigma公司）用3.5%的高氯酸水溶液配制成0.05%的CBB染色液。精子懸液離心（500 r/min, 5 min），沉淀以固定液即含4%甲醛的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）固定10 min，離心去上清，PBS洗滌2遍；適量PBS懸浮沉淀，吸取20μl精子懸液涂片晾干；精子涂片用CBB染色液滴于玻片染30min,三蒸水沖洗玻片，晾干，中性樹脂封片。并在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、統(tǒng)計(jì)。染色后，所有精子尾部均染成紫藍(lán)色，頭部則呈a型和b型兩種染色類型。a型為已經(jīng)發(fā)生頂體反應(yīng)的精子，頂體區(qū)染成紫藍(lán)色而頂體后區(qū)不染色或呈淺紫色，少量精子頂體后區(qū)也呈紫藍(lán)色；b型為沒有發(fā)生頂體反應(yīng)的精子,頂體區(qū)不染色或染淺紫色，其余部位染色與A型相似，見圖1B。

圖1 精卵結(jié)合圖及頂體反應(yīng)圖

三、IVF-ET

（一）受精及胚胎培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)組（A組）根據(jù)受精方式不同分為常規(guī)體外受精組（A1組）和ICSI受精組（A2組），A1組和對照組（B組）采用常規(guī)的體外受精。取卵后3h加精子，精卵孵育6h后去除卵周顆粒細(xì)胞，觀察第二極體是否排出，所有卵母細(xì)胞均無第二極體排出判斷為完全不受精，排出第二極體卵母細(xì)胞數(shù)與成熟卵母細(xì)胞數(shù)之比＜30%判斷為低受精率，對未受精的MⅡ期卵及時(shí)行早期補(bǔ)救ICSI受精。受精后16～18h觀察原核，出現(xiàn)2個(gè)原核和2個(gè)極體為正常受精卵。

（二）胚胎按以下評分標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)

形態(tài)學(xué)指標(biāo) 4’-卵裂球大小均勻，碎片為≤5%；3’-卵裂球大小均勻或不等，碎片6%～20%；2’-卵裂球體積相等或不等，碎片21%～50%；1’-卵裂球少，碎片＞50%。1、2級(jí)胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)下列情況，胚胎評級(jí)時(shí)在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上降一級(jí)：（1）授精20h內(nèi)未見到原核，48h證實(shí)為延遲受精的胚胎。（2）取卵后48h超過8細(xì)胞或72h未超過5細(xì)胞。正常受精4、3級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。取卵后培養(yǎng)24～48h觀察胚胎形態(tài)，將優(yōu)質(zhì)胚胎移植到宮腔內(nèi)。胚胎移植后14d檢測尿或血HCG陽性，移植后3～5周超聲檢查見胎心搏動(dòng)為臨床妊娠。移植時(shí)先選擇常規(guī)受精來源的胚胎，若無常規(guī)受精來源胚胎則移植ICSI受精胚胎。

（三）精卵結(jié)合數(shù)、透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠率的計(jì)算公式

每個(gè)卵子的精卵結(jié)合數(shù)=結(jié)合在透明帶的精子數(shù)目；透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)率=發(fā)生頂體反應(yīng)的精子數(shù)目/鏡下總的精子數(shù)目×100% ；受精率=正常受精卵數(shù)/卵-冠-丘復(fù)合體數(shù)×l00%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵數(shù)×l00%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植周期數(shù)×l00%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率預(yù)測受精結(jié)果，用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic, ROC）曲線來判斷。精卵結(jié)合數(shù)和透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)比較用t檢驗(yàn)，透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)率和受精率的相關(guān)性用Spearman檢驗(yàn)，妊娠率的比較用卡方驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組基本情況比較

比較A組和B組基本情況：男、女方年齡、不孕年限、精液量和NP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精液參數(shù)中，精子濃度、PR、正常形態(tài)率和精子存活率，B組均高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 兩組患者基本情況比較

二、兩組治療結(jié)局

兩組獲卵總數(shù)ICSI卵子數(shù)（n）、 兩組優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中受精率B組大A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是經(jīng)補(bǔ)救ICSI（rescue intracytoplasmic sperm injection，RICSI）后受精率（%），差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 兩組臨床治療結(jié)局比較

三、兩組精卵結(jié)合數(shù)和透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)率的比較

實(shí)驗(yàn)組有6例平均精卵結(jié)合數(shù)目小于3，由于無法繼續(xù)進(jìn)行透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)，故將6例患者剔除出去。A1組的受精率與透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率具有明顯的相關(guān)性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0. 889，P＜0.01），表明透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)率高的精子其受精結(jié)果明顯好于頂體反應(yīng)率反應(yīng)率低的精子的，見表3。

表3 兩組精卵結(jié)合數(shù)、透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)率的比較

實(shí)驗(yàn)A1組頂體反應(yīng)率和受精率ROC曲線分析顯示：當(dāng)透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率高于68%時(shí)，其受精率高；低于68%時(shí)，受精率明顯降低（見圖2、圖3），本研究中受精率結(jié)果的高低60%為標(biāo)準(zhǔn)。利用透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率來預(yù)測受精結(jié)果具有較好的診斷價(jià)值。

圖2 透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率與受精率相關(guān)性比較

圖3 透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率預(yù)測其受精結(jié)果ROC曲線

討 論

精液的常規(guī)檢查一直作為一個(gè)很重要的參考指標(biāo)來指導(dǎo)臨床的治療方案，伴隨著男性不育研究的深入，傳統(tǒng)的精液分析已不足以對男性生育能力準(zhǔn)確全面的了解，并且研究表明，精液常規(guī)分析與實(shí)際生育力僅有70%的符合率[4]。

人精卵結(jié)合過程和機(jī)制是復(fù)雜的，受精過程也是精子與卵子之間發(fā)生的相互作用的過程，其中包括精卵結(jié)合、精子發(fā)生頂體反應(yīng)（acrosome reaction, AR）、精子穿透卵透明帶以及精卵融合等一系列過程，而精卵結(jié)合是受精過程的第一步, 因此精卵結(jié)合的特異性是保證受精過程特異性的關(guān)鍵中，至關(guān)重要，而頂體反應(yīng)也是受精過程中的一個(gè)重要步驟。而目前仍未確定出一種精確的檢測精子功能的方法。因此我們采用簡單可行的精卵結(jié)合試驗(yàn)[5,6]，采用任何精子一起培養(yǎng)過的GV和MI期的未成熟卵，或者是ICSI受精失敗的卵子但沒有任何精子穿進(jìn)透明帶和卵黃膜。而形態(tài)異常、自動(dòng)活化、老化和多精受精的卵母細(xì)胞則不能用于本研究。有報(bào)道顯示在ICSI治療受精失敗卵子中約有80%的卵子仍可以和其他精子進(jìn)行精子功能檢測，即可以和精子進(jìn)行特異性結(jié)合并且能夠誘發(fā)頂體反應(yīng)[3]。

測定頂體的完整性有很多種方法，包括卵泡液、孕酮、鈣離子載體A23187都能誘導(dǎo)頂體反應(yīng)，但這些生物及化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)的頂體反應(yīng)與透明帶誘發(fā)的頂體反應(yīng)并沒有相關(guān)性[5]，因而人透明帶還是頂體反應(yīng)最有效的誘導(dǎo)劑[7]。有報(bào)道顯示：CBB染色法，可在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作,簡便經(jīng)濟(jì)并且可以保存結(jié)果，對精子標(biāo)本的要求不高，易在臨床實(shí)驗(yàn)室中推廣[8]。

本研究顯示：男性不育組平均精卵結(jié)合數(shù)（65.84±10.27）明顯低于完全女方因素引起的不孕不育組的平均精卵結(jié)合數(shù)（89.93±8.73）。其中有6例平均精卵結(jié)合數(shù)目小于3，占男性不育患者的比例為13.6%（6/44）。提示男性不育患者的精子與卵子的結(jié)合率是明顯降低的。2007年，Liu等[10]在研究不明原因性不育患者的精卵結(jié)合能力時(shí)候，就發(fā)現(xiàn)約有13%存在精子與透明帶結(jié)合障礙，并經(jīng)其命名為精子與透明帶結(jié)合障礙癥（disordered sperm-zona pellueid binding-DSZPB）。同樣我們的研究也發(fā)現(xiàn)男性不育患者透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率（43.87± 17.65）%，其中有6例患者平均精卵結(jié)合數(shù)目小于3，因而也就無法進(jìn)行透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)檢測，在剩余的38例患者進(jìn)行檢測當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，其中有4例的透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率＜20%，與完全女方因素引起的不孕不育組的透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率（79. 48±14. 45）%相比，也是明顯降低的。從而也就說明男性不育患者不僅精子與卵子的結(jié)合能力降低，而且也有可能伴有卵子透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)能力也下降。類似這種，精子能和卵子的透明帶正常結(jié)合，但是卻不發(fā)生頂體反應(yīng)這種特異性精子功能缺陷，有學(xué)者將其命名為透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)缺陷癥[12]（disordered zona-pellucida induced aerosome reaction，DZPIAR）。到目前為止，DZPIAR癥發(fā)生的確切的原因國內(nèi)外尚無明確闡述[11]。

男性不育患者可能伴有精子功能缺陷，諸如精子與卵子的結(jié)合能力、精子頂體反應(yīng)率明顯下降，精子受精功能降低。如果這部分患者做IVF治療，受精率下降，甚至受精完全失敗，導(dǎo)致無胚胎移植。往往會(huì)給病人帶來精神及經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。因此對患有生育障礙男性患者進(jìn)入治療周期前可以利用廢棄卵子進(jìn)行精卵結(jié)合及透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)來判斷精子受精能力，檢測出精子功能缺陷患者，為選擇IVF或ICSI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。如此既可避免一些IVF的受精完全失敗，又可避免過度的ICSI治療，減少子代遺傳和先天缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，22例男性不育患者行IVF受精，其受精率（43.37%），其中有5例受精率小于30%，占行IVF助孕男性不育患者的比例為22.7%（5/22），明顯低于完全女方因素引起的不孕不育組（73.21%）以及實(shí)行ICSI助孕的組（66.19%），然而此5例患者經(jīng)早期補(bǔ)救ICSI后A1組受精率為63.36%，與完全女方因素引起的不孕不育組以及實(shí)行ICSI助孕組相比無明顯差異，并且之后的優(yōu)胚率與妊娠率與完全女方因素引起的不孕不育組以及實(shí)行ICSI助孕組相比，差異都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與嚴(yán)正杰等[12]研究相符，他們發(fā)現(xiàn)常規(guī)IVF失敗的患者，6h內(nèi)盡早行補(bǔ)救ICSI可提高受精率，改善臨床妊娠結(jié)局。從而我們發(fā)現(xiàn)男性不育患者不僅有常規(guī)的精液參數(shù)的異常，并且會(huì)伴有的精子功能異常，從而導(dǎo)致受精率下降，但是一旦受精，對以后的胚胎發(fā)育可能無影響。因此補(bǔ)救ICSI可作為常規(guī)IVF失敗后的補(bǔ)救措施。并且考慮ICSI技術(shù)本身潛在風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)盡量謹(jǐn)慎使用該技術(shù)。因?yàn)槠浜妥匀蝗焉锵啾葴p少了自然選擇的篩選，引入不可預(yù)測因素，可能會(huì)增加后代異常的發(fā)生率。但在評估ICSI技術(shù)安全性時(shí)，應(yīng)綜合考慮其父母本身缺陷和非技術(shù)性影響因素，給予ICSI技術(shù)公正的認(rèn)識(shí)。對ICSI可能的不良反應(yīng)，置之不理是不恰當(dāng)?shù)?。選擇合適對象和采取嚴(yán)格操作規(guī)程后其結(jié)果應(yīng)該是安全可靠的。

精卵結(jié)合及透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)是簡單有效的檢測方法，它能很好預(yù)測患者的精子功能，對于IVF后廢卵較多的生殖醫(yī)學(xué)中心，可以考慮利用廢棄卵子進(jìn)行精卵結(jié)合及透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)來判斷精子受精能力的高低，以決定是否選擇IVF或ICSI受精方式。而對于首次行IVF治療的男性不育患者，如果不具備以上試驗(yàn)條件時(shí)，在獲得卵子數(shù)目較多的情況下，可以考慮采取早期補(bǔ)救ICSI方法。這樣有利于提高受精率，避免完全受精失敗，獲得較好的妊娠結(jié)局，也可為以后的治療提供更好的方案，并且可以降低ICSI的操作率，降低患者的治療費(fèi)用，減少后代異常的發(fā)生率。然而有對于可疑受精失敗的不育患者原發(fā)不孕或不明原因不孕患者，體外受精助孕時(shí)，有學(xué)者選擇Half-ICSI方式受精[13]。但是因擔(dān)心受精失敗而行Half-ICSI會(huì)導(dǎo)致絕大部分不必要的ICSI，加重患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療資源的浪費(fèi)，再者對于獲卵較少，而行half-ICSI無實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，并且有研究顯示，盡管早補(bǔ)救ICSI授精方式有增加多精受精的風(fēng)險(xiǎn)，但是早補(bǔ)救ICSI是優(yōu)于half-ICSI的授精方式，因?yàn)樵贗VF受精成功周期中實(shí)行早補(bǔ)救ICSI，其優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率和臨床妊娠率明顯高于的均明顯低于half-ICSI；而在IVF受精失敗周期中，早補(bǔ)救ICS的受精率顯著高于half-ICSI[14]。

精子功能試驗(yàn)可探知不孕的原因，使不孕夫婦放棄無謂的浪費(fèi)，做出最理智的生育決策，選擇有成效的治療方法或果斷的治療決定。因?yàn)樽罱K生育計(jì)劃的決定者是夫妻雙方，其有權(quán)知道各種妊娠方式的成功率，而精子功能測試及其遺傳和男科學(xué)試驗(yàn)，能幫助不孕夫婦做出明智的知情選擇。

綜上所述，本項(xiàng)目應(yīng)用精卵結(jié)合試驗(yàn)對男性不育患者進(jìn)行精子功能檢測；探討精卵結(jié)合檢測在體外受精 、胚胎移植術(shù)助孕中的應(yīng)用價(jià)值。國內(nèi)外鮮有相似的報(bào)道。應(yīng)用精卵結(jié)合實(shí)驗(yàn)可以在一次檢測過程中連續(xù)完成精子-透明帶結(jié)合試驗(yàn)、透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)和精子-透明帶穿透試驗(yàn)3個(gè)項(xiàng)目檢測。實(shí)驗(yàn)操作性強(qiáng)，結(jié)果重復(fù)性好，為研究男性不育患者的精子功能的可行性檢測，有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。而早期補(bǔ)救ICSI可以有效避免完全不受精或低受精率的情況，可以顯著改善實(shí)驗(yàn)室及臨床結(jié)局。

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13 杜紅姿, 劉寒艷, 龍曉林, 等. half-ICSI中IVF受精率的差異對臨床結(jié)局的影響. 生殖與避孕 2011; 31(5): 339-343

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（2013-11-08收稿）

Correlation of sperm-oocyte interaction and IVF clinical outcomes*

Sun Baogang, Wang Lixia, Cao Jinghe, Liang Lunan, Yang Aijun, Wang Xuenan, Niu Huanfu
Aff liated Hospital of Jining Medical College,Jining, Shangdong 272000, China

ObjectiveTo study the clinicl significance of the sperm-zona pellucida (ZP) binding and ZP-induce dacrosome reaction for patients with man infertility and discuss its applicaton value in IVF.MethodsBased on the causes of infertility, 89 patients were divided into an unexplained infertility group( 44cases,GroupA) and a pure female tubal factor group( 44cases,Group B). The patients in GroupA were further randomly divided into two subgroups Group A1(patients treated with conventional in vitrofertilization, IVF) and Group A2(patients treated with intracytoplasmic sperm injection (ICSI) fertilization). Patients in Group B receivedconventional IVF. The fertilization rate of Group A1 was less than 30%，the early rescue ICSI was carried out. Sperm-ZP binding and ZP-induced acrosome reaction experiments were conducted with 2 groups of men’s sperms separately. The number of sperm-egg binding and ZP-induced acrosome reaction rate were compared and the relationship between the ZP-induced acrosome reaction and fertilization rate was analyzed. Thefertilization rate, good embryo rate and pregnancy rate in patients with man infertility after fertilization in 2 ways were investigated.ResultsThe average number of sperm-egg binding (65.84±10.27) and the ZP-induced acrosome reaction rate (43.87±17.65)% in Group A were lower than those in Group B [89.93±8.73, (79.48±14.45)% ]. The difference between the average number of sperm-egg binding and the ZP-induced acrosome reaction was signif cant (P<0.05). The fertilization rate of GroupA1 was signif cantly lower than that of Group B and GroupA2 (P<0.05). But there was no signif cant difference in the fertilization rate among the 3 groups after early rescue ICSI. And there was also no signif cant difference in the good embryo rate among the 3 groups. There was no signif cant difference between Group A2 and B in fertilization rate and good embryo rate (P>0.05). There was no signif cant difference in pregnancy rate between Group A and B (P>0. 05). Fertilization rate and the rate of acrosome reaction had marked positive correlation with statistical significance(r=0. 889,P<0.01).ConclusionZP binding and ZP-induced acrosome reaction are very important experiments for evaluating sperm function of male patients with infertility. They can predict sperm fertilization ability and provide valuable information for clinical treatment. Early rescue ICSI can effectively avoid complete fertilization failure or low fertilization rate, and signif cantly improve clinical outcome.

infertility,male; acrosome reaction; sperm injections, intracytoplasmic; fertilization in vitro

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.005

R 698.2; R 321-33

資助: 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院青年基金項(xiàng)目(編號(hào): JYQ2011KM056)