宋麗君 陳 碧 韋 冰

廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心（湛江 524001）

不同精子濃度對(duì)長(zhǎng)時(shí)體外受精結(jié)局的影響

宋麗君 陳 碧 韋 冰

廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心（湛江 524001）

目的探討體外受精-胚胎移植（IVF-ET）過(guò)夜受精周期中不同精子濃度對(duì)卵子受精與胚胎發(fā)育的影響。方法 根據(jù)過(guò)夜受精周期中不同精子濃度，分為A組（50×104/ml）與 B組（15×104/ml），比較兩組的受精率、2原核率（2PN率）、2原核卵裂率（2PN卵裂率）、多原核率（多PN率）、優(yōu)胚率、臨床妊娠率及種植率。結(jié)果A 組受精率、2PN率高于 B 組（P＜0.05），而B組優(yōu)胚率、種植率高于A組（P＜0.05），兩組2PN卵裂率、臨床妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論過(guò)夜體外受精周期中適當(dāng)降低精子濃度能提高胚胎質(zhì)量，從而提高優(yōu)胚率和種植率，改善臨床結(jié)局。

受精,體外; 胚胎移植; 妊娠結(jié)局

隨著宮腔內(nèi)人工受精（intrauterine insemination, IUI）、體外受精-胚胎移植（in vitrofertilizationembryo transfer IVF-ET）等輔助生殖技術(shù)的廣泛應(yīng)用, 有關(guān)受精方式及受精濃度對(duì)輔助生殖技術(shù)治療結(jié)局的影響日益受到人們的關(guān)注, 并就此進(jìn)行了大量研究[1]。本文比較過(guò)夜體外受精中兩種受精濃度對(duì)治療結(jié)局的影響, 探索合適的受精濃度，為臨床受精方式及受精濃度的選擇提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

2013年1月至8月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心行常規(guī)IVF治療的患者納入研究。

二、控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation COS）方案

均采用短效長(zhǎng)方案，注射短效促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone agonists GnRHa）0.05～0.1mg/d至注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin HCG）日，當(dāng)垂體達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)開始給予促性腺激素（Gonadotropin Gn）。根據(jù)患者的年齡、基礎(chǔ)促卵泡激素（follicle stimulating hormone FSH）值、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)目、體重指數(shù)決定Gn啟動(dòng)劑量。監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育并測(cè)血激素水平，個(gè)體化調(diào)整Gn用量及確定注射HCG時(shí)間，至少1個(gè)卵泡直徑達(dá)19mm時(shí)，或2個(gè)卵泡直徑達(dá)18mm時(shí)，或3個(gè)卵泡直徑達(dá)17mm，血雌二醇（E2）達(dá)到平均每個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡（≥14mm）250～300 ng/L時(shí)，當(dāng)晚注射HCG 5 000～100 00IU，注射后34～36h取卵。

三、卵母細(xì)胞的回收

將1支試管的卵泡液倒入皿中，晃動(dòng)液面使液體均勻分布在皿中，按照一定順序認(rèn)真快速地查找卵冠丘復(fù)合體（ovum crown cumulus complexes, OCCS），找卵時(shí)，應(yīng)盡量縮短卵母細(xì)胞在非生理?xiàng)l件下的操作時(shí)間。將找到的OCCS沖洗后，轉(zhuǎn)至裝有受精液的培養(yǎng)皿內(nèi)，放回培養(yǎng)箱進(jìn)行成熟培養(yǎng)。

四、精液處理及實(shí)驗(yàn)分組

密度梯度+洗滌后上游法處理精液，調(diào)精液終濃度為10～20×106/ml 。授精精液濃度分組依據(jù)《體外受精－胚胎移植實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》[1]， A組（13次取卵周期）：采用微滴受精，每100μl微滴加5萬(wàn)條精子，調(diào)受精濃度約為50×104/ml，2～3卵/微滴；B組（28次取卵周期）：采用四孔皿受精，每孔700μl受精液，每孔加10萬(wàn)條精子，調(diào)受精濃度約為15×104/ mL，2～3卵/孔。

五、過(guò)夜受精、胚胎培養(yǎng)及優(yōu)胚標(biāo)準(zhǔn)

均采用過(guò)夜受精，HCG注射后39～40h受精，受精后的第二天早上，即加精（17±1）h（剝除顆粒細(xì)胞后）觀察原核，正常受精卵表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)有兩個(gè)原核，可見第二極體。受精后置序貫培養(yǎng)液中培養(yǎng)，（44±1）h、（68±1）h觀察D2、D3胚胎形態(tài)。胚胎評(píng)估：1級(jí)為卵裂球大小均勻，無(wú)碎片或碎片＜10%；2級(jí)為裂球大小不均, 碎片10%～25%；3級(jí) 卵裂球大小不均，碎片＞25%或存在多核現(xiàn)象。優(yōu)胚標(biāo)準(zhǔn) （D3）：評(píng)為1級(jí)的7～9細(xì)胞，無(wú)多核現(xiàn)象，胞質(zhì)均勻，無(wú)顆粒及空泡現(xiàn)象。

六、胚胎移植及隨訪

受精后第3天選擇優(yōu)胚移植，根據(jù)B超監(jiān)測(cè)，置移植外管于宮頸內(nèi)口，將裝載胚胎的內(nèi)管經(jīng)外管插入，距宮底約10～20mm處，緩慢注入胚胎，固定注射器活塞避免胚胎回吸。移植后進(jìn)行常規(guī)黃體支持，14d查血HCG陽(yáng)性，28d B超檢查子宮內(nèi)有孕囊及心管搏動(dòng)為臨床妊娠。

七、統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，利用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

本中心2013年1月至8月36例不孕患者進(jìn)行常規(guī)IVF，共41次取卵周期，22次新鮮胚胎移植周期。不孕女方患者平均年齡（31.4±4.7）歲，不孕年限（3.8±2.8）年，原發(fā)21例,繼發(fā)19例，平均獲卵數(shù)（8.6±5.0）枚，平均獲卵率（94.1±65.2）%，平均成熟卵（metaphase Ⅱ, MⅡ）數(shù)（7.2±4.6）枚，平均卵成熟率為（85.5±18.0）%，平均受精率為（82.3± 20）%，平均2原核率（2PN率）為（71.5±23.4）%，平均多原核率（多PN率）為（5.5±11.0）%，平均2原核卵裂率（2PN卵裂率）為（95.6±16.4）%，平均優(yōu)胚率為（37.9±34.7）%，新鮮周期妊娠率為50%（11/22），種植率為34.1%（15/44），流產(chǎn)率為9.1%（1/11），多胎（均為雙胎）發(fā)生率為36.4%（4/11），宮外孕發(fā)生率為0。

二、兩組一般情況比較

兩組患者平均年齡、不孕年限、原發(fā)不孕比例、平均獲卵數(shù)、平均獲卵率、平均MⅡ卵數(shù)、平均卵成熟率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 兩組一般情況比較

三、兩組實(shí)驗(yàn)室及臨床結(jié)局比較

A 組受精率、2PN率高于 B 組（P＜0.05），而B組優(yōu)胚率、種植率高于A組（P＜0.05），兩組2PN卵裂率、臨床妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組實(shí)驗(yàn)室及臨床結(jié)局比較

討 論

目前已經(jīng)有較多的生殖中心采用了短時(shí)受精方式進(jìn)行體外受精，獲得較好臨床妊娠率[2,3]。但短時(shí)受精過(guò)早去除顆粒細(xì)胞，對(duì)卵母細(xì)胞受精過(guò)程的刺激是否會(huì)引起受精卵異常發(fā)育目前尚不明確，目前有一些研究表明縮短精卵孵育時(shí)間并不能改善胚胎質(zhì)量及妊娠率，受精早期脫顆粒細(xì)胞的機(jī)械刺激會(huì)增加多精受精率，對(duì)胚胎發(fā)育有不利影響[4,5]。本文中36例不孕患者均采用傳統(tǒng)的過(guò)夜受精方式（精卵共培養(yǎng)16～20 h），平均受精率為82.3%，平均2PN卵裂率為95.6%，平均優(yōu)胚率為37.9%，新鮮周期妊娠率為50%，種植率為34.1%。本中心通過(guò)過(guò)夜受精方式，取得較好的臨床妊娠率及種植率，提示IVF的這種過(guò)夜受精方式具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單，不易損傷胚胎等優(yōu)點(diǎn)，適合在基層醫(yī)院推廣。

影響IVF-ET成功率的因素很多，移植高質(zhì)量的胚胎是提高妊娠率的關(guān)鍵[6]。過(guò)夜受精中，精子數(shù)量的多少直接影響卵子的受精率及發(fā)育潛能。傳統(tǒng)過(guò)夜受精所需的精子參數(shù)范圍尚不清楚，能否在較低的精子濃度下獲得更多的優(yōu)質(zhì)胚胎是本文的觀察目的。本文根據(jù)過(guò)夜受精周期中不同的受精濃度，分為兩組A組（50×104/mL）， B組（15×104/mL），兩組患者平均年齡、不孕年限、原發(fā)不孕比例、平均獲卵數(shù)、平均獲卵率、平均MⅡ卵數(shù)平均卵成熟率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明兩組患者具有可比性。A組受精率及2PN率高于B組,可能與A組精子濃度相對(duì)高有關(guān)。多精受精是IVF中常見的異常受精類型，通常是兩條或兩條以上精子同時(shí)進(jìn)入卵子所致，受精濃度過(guò)高可能引起多精受精，但本文B組中受精濃度雖然低，多PN率卻高于A組，這可能與B組不成熟卵比例較高有關(guān)，不成熟卵或過(guò)熟卵皮質(zhì)反應(yīng)異常容易導(dǎo)致多精受精的發(fā)生，多精受精的出現(xiàn)與卵子成熟度密切相關(guān)。鄧翎潔的研究也發(fā)現(xiàn)在卵泡數(shù)及獲卵數(shù)較多的周期中，容易出現(xiàn)一些不成熟或過(guò)熟的卵子，這類卵子發(fā)生多精受精的可能性大，多精受精率與受精密度無(wú)關(guān)[7,8]。

兩組2PN卵裂率及妊娠率無(wú)差別,但B組優(yōu)胚率及種植率明顯高于A組（P＜0.05）。說(shuō)明適當(dāng)降低精子濃度可提高胚胎質(zhì)量及改善妊娠結(jié)局.有研究認(rèn)為精子代謝會(huì)產(chǎn)生活性氧 （reactive oxygen species, ROS）導(dǎo)致透明帶硬化，影響胚胎的正常孵出與植入，降低精子濃度可減少ROS，降低其對(duì)透明帶的影響，使胚胎順利孵出與植入，提高胚胎的著床率，本文中精子濃度為15×104/mL的B組優(yōu)胚率及種植率明顯高于精子濃度為50×104/mL的 A組,并且B組的妊娠率（63.6%）也高于A組（36.4%），說(shuō)明降低卵子的受精濃度雖然對(duì)受精率略有影響，但優(yōu)胚率明顯增加，從而提高臨床妊娠率及種植率。

1 黃國(guó)寧, 孫海翔. 體外受精－胚胎移植實(shí)驗(yàn)室技術(shù). 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2012

2 刁英, 楊智敏, 譚兵兵, 等. 短時(shí)受精并即刻脫顆粒細(xì)胞對(duì)IVF-ET治療周期的影響. 中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志 2011; 19(2): 106-108, 112

3 江楠, 王啟釗. 縮短精卵共孵育時(shí)間對(duì)人類體外受精結(jié)局的影響. 中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志 2011; 19(3): 7-8, 14

4 宋成, 萬(wàn)才云, 成金泉, 等. 早期去除顆粒細(xì)胞對(duì)體外受精和胚胎發(fā)育的影響. 中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志 2013; 21(4): 144-146

5 宋小兵, 張翠蓮, 張欽憲. 不同脫顆粒細(xì)胞時(shí)間對(duì)IVFET治療周期的影響. 當(dāng)代醫(yī)學(xué) 2013; 19(5): 40-44

6 Anthony N Imudia, l Yoko Suzuk il. Retrieval of trophoblast cells from the cervical canal for prediction of abnormal pregnancy: a pilot study.Human Reproduction2009; 24(9): 2086-2092

7 黃學(xué)鋒, 張巍. 人類體外受精中的異常受精. 生殖醫(yī)學(xué)2009; 18(3): 184-186

8 鄧翎潔, 李柳銘, 翟丹梅. 人類體外受精助孕治療中多原核受精的相關(guān)因素分析. 廣西科學(xué)院學(xué)報(bào) 2013; 29(2): 114-11

（2013-09-02收稿）

The effects of different sperm concentrations on the clinical outcome of ovum fertilization and embryo development duringin vitroovernight fertilization cycle

Song Lijun, Chen Bi, Wei Bing
Reproductive Center of Aff liated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang Guangdong 524001, China

ObjectiveTo investigate the effects of different sperm concentrations on the outcome of ovum fertilization and embryo development during in vitro overnight fertilization cycle.MethodsAccording to the different sperm concentrations during overnight fertilization cycle, the patients were divided into Group A (50×104/ml) and B group (15×104/ ml). The fertilization rates, 2 pronucleus(PN) rate, 2 PN cleavage rate, multi-PN rate, excellent embryo rate, clinical pregnancy rate and implantation rate between the two groups were comparatively analyzed.ResultsThe rates of fertilization and 2PN of the group A were higher than those of group B (P<0.05), and excellent embryo rate and implantation rate of the group B were all higher than those of group A(P<0.05), whereas the 2PN cleavage rate and the clinical pregnancy rate between the two groups had no signif cant difference (P＞0.05).ConclusionModerately lowered sperm concentration might improve the excellent embryo rate and implantation rate during the overnight fertilization of IVF, thus ameliorate clinical outcome.

fertilization in vitro; embryo transfer; pregnancy outcom

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.006

R 321-33