孫艷美，潘曉燕，曹詩雯，楊喆清，王立新

(吉林醫(yī)藥學院生殖醫(yī)學中心，吉林 吉林 132013)

隨著輔助生殖技術在臨床廣泛應用于治療不孕不育癥，一些母嬰并發(fā)癥的發(fā)生也越來越頻繁[1-2]。由于在一個試管嬰兒周期中通常會有幾個胚胎產(chǎn)生，我國一般移植≥2枚胚胎以保證妊娠結局，這就導致我國近30年來多胎妊娠率高達30%～40%[3]。為避免多胎妊娠，實施單胚胎移植(single embryo transfer,SET)是目前生殖醫(yī)學研究的重要方向，開展SET需要對發(fā)育周期內胚胎的發(fā)育狀態(tài)進行全面的評估，挑選最具發(fā)育潛能的胚胎進行移植。傳統(tǒng)的形態(tài)學評估無法全面評估胚胎發(fā)育潛能，缺少公認的量化指標，從而導致多胎妊娠等不良妊娠結局[4]。時差成像技術(time-lapse imaging，TLI)是非侵入性地評估胚胎在體外發(fā)育的手段，在臨床體外受精過程中引入時差成像技術，可以在整個培養(yǎng)期間對胚胎培養(yǎng)微環(huán)境進行無干擾的監(jiān)測，跟蹤胚胎的發(fā)育過程，通過觀察胚胎形態(tài)動力學和動力學參數(shù)來選擇發(fā)育潛力最大的胚胎，有效的輔助單胚胎移植。

近年研究認為，受精胚胎早期卵裂是評估胚胎發(fā)育重要指標，有助于預測胚胎的發(fā)育潛能和植入能力[5-6]。由于豬與人具有相似的生理學特性，豬胚胎的體外生產(chǎn)已廣泛應用于為畜牧業(yè)生產(chǎn)以及生物醫(yī)學的研究，本研究以孤雌激活的豬胚胎為對象，通過TLI系統(tǒng)觀察胚胎早期卵裂的情況，探討初次卵裂時間對胚胎發(fā)育能力的影響，挑選出高質量的植入前胚胎，并闡明初次卵裂的影響機制，為臨床輔助生殖技中實施SET的可行性提供理論和機制基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

豬卵巢購自吉林市成祥屠宰場。

TCM-199、NaHCO3、NaCl、KCl、BSA、TBST、PBS、Hoechst33342、Tris均購自Sigma公司；HRP-Linked Antibody購自Abcam公司；SDS電泳液、ECL顯色液均購自碧云天生物技術研究公司。

1.2 卵丘-卵母細胞復合體收集及體外成熟培養(yǎng)

用注射器從卵巢表面抽取2～6 mm卵泡的卵母細胞，在立體顯微鏡下?lián)斐?層以上卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes,COCs)用于成熟培養(yǎng)。將符合要求的COCs挑選出，放入150 μL TCM-199微滴中，在38.5 ℃、100%濕度和5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)44 h。

1.3 成熟豬卵母細胞的孤雌激活及體外胚胎培養(yǎng)

在0.1%透明質酸酶中吹打除去卵母細胞周圍的顆粒細胞，在體視顯微鏡下挑選出具有第一極體的成熟卵母細胞，在5 μmol/L離子霉素中處理5 min后，在2.5 mmol/L二甲氨基嘌呤中孵育4 h，移到100 μL/滴的胚胎培養(yǎng)液中在38.5 ℃、100%濕度和5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.4 Time-Lapse成像系統(tǒng)觀察胚胎發(fā)育

將胚胎移入Time-Lapse成像系統(tǒng)的培養(yǎng)盒中，利用Time-Lapse成像軟件連續(xù)拍攝胚胎的整個發(fā)育過程，確定其第一次卵裂的時間。有研究表明[7]豬卵母細胞孤雌激活后21 h已經(jīng)開始了細胞的動力學變化，到48 h基本完成了二細胞分裂活動。以此為據(jù)，根據(jù)第一次卵裂速度的快慢將孤雌激活胚胎分為早期卵裂組(<24 h)、中期卵裂組(24～30 h)和晚期卵裂組(30～48 h)。胚胎分開培養(yǎng)并統(tǒng)計胚胎的桑葚胚率和囊胚率，以確定其對植入前胚胎發(fā)育率和發(fā)育質量的影響。

1.5 免疫熒光法檢測凋亡相關蛋白

分別收集早期卵裂、中期卵裂、晚期卵裂組培養(yǎng)至囊胚期的胚胎，用PBS洗5min，洗3遍后，封閉液室溫封閉1 h，然后分別用凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、P53的抗體4 ℃孵育過夜。第2天，棄去一抗孵育液，PBS洗3次，每次5 min。滴加熒光二抗避光濕盒中孵育1 h，每次5 min。滴加Hoechst33342避光染色5 min，PBS洗3次，每次5 min。封片液封片后共聚焦顯微鏡下立即觀察。

1.6 Western-blot檢測細胞周期蛋白

分別取早、中、晚期卵裂囊胚期胚胎，加入含1%PMSF的RIPA強裂解液提取蛋白。上樣，電泳，將電壓設置為80 V，約20 min樣品通過濃縮膠進入分離膠，將電壓調高到150 V，待溴酚蘭跑到膠底部時終止電泳。300 mA轉膜約45 min后，將轉移后的膜放入15%(W/V)脫脂奶粉(15 g脫脂奶粉，100 mL TBST)中，室溫搖床上緩慢搖動狀態(tài)下封閉1h，最后PVDF膜用細胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、細胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependent kinase1，Cdk)1、Cdk2的抗體孵育4 ℃過夜。次日，1×TBST室溫輕搖洗滌PVDF膜3次(每次10 min)，用HRP-抗體室溫孵育PVDF膜1 h。最后,將顯影液均勻覆在膜表面，Tanon 4600SF凝膠成像系統(tǒng)進行攝片。Image J軟件對圖片灰度值進行分析，最后對蛋白印跡結果作統(tǒng)計學分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 不同卵裂時間豬孤雌激活胚胎的桑葚胚率和囊胚率

孤雌激活，根據(jù)初次卵裂時間分為早、中、晚卵裂胚胎后，選出卵裂球形態(tài)均勻的2細胞胚胎進行體外培養(yǎng)，胚胎卵裂球大小均勻、透明帶完整，形態(tài)符合胚胎的發(fā)育階段被認為是正常發(fā)育的胚胎(圖1)。結果表明，同一批孤雌激活豬卵母細胞，24 h內發(fā)生初次卵裂的胚胎數(shù)明顯多于中期卵裂組和晚期卵裂組，早期卵裂組桑葚胚率、囊胚率明顯高于中期卵裂組(P<0.05)和晚期卵裂組(P<0.01)，中期卵裂組高于晚期卵裂組(表1)，但差異不明顯(P>0.05)。

表 1 早、中、晚期卵裂豬孤雌激活胚胎的桑椹胚率和囊胚率

2.2 不同卵裂時間對囊胚中凋亡相關基因表達的影響

分別收集每個組發(fā)育的囊胚，免疫熒光法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、P53的相對表達水平。結果顯示(圖2)，早期卵裂組囊胚中凋亡基因Bax、P53表達顯著低于中期和晚期卵裂組(P<0.01),而抗凋亡基因Bcl-2在早期卵裂組中的表達顯著高于中期和晚期卵裂組(P<0.01)，與中期和晚期卵裂組比較沒有差異。

2.3 不同卵裂時間對囊胚蛋白表達的影響

結果顯示(圖3)，早期卵裂組囊胚Cyclin B1、Cdk1和Cdk2蛋白的表達明顯高于中期和晚期卵裂組(P<0.05),中期與晚期相比差異不明顯。

3 討 論

體外繁殖技術(體外受精、體細胞核移植、孤雌生殖)中，人和牛的胚胎發(fā)育到囊胚的不到50%，豬胚胎體外囊胚發(fā)育率更低，只有20%～30%。與體內發(fā)育胚胎相比，體外繁殖技術胚胎的低發(fā)育率和胚胎質量低下是目前面臨的主要挑戰(zhàn)，著床前階段的胚胎衰竭是在全世界范圍內導致農業(yè)和科研生殖率低下的一個重要原因[8]。如何安全有效地篩選出最具發(fā)育潛能的胚胎是開展體外繁殖技術研究的重要方向。研究顯示早期卵裂作為胚胎發(fā)育過程的重要環(huán)節(jié)，在預定時間段內發(fā)生卵裂的胚胎，其染色體異常率低,種植能力高，胚胎具有較高發(fā)育潛能和較好的種植能力，可以獲得較好的妊娠結局[9],這些研究多集中在人和小鼠上，而且缺乏具體的機制研究。本研究以孤雌激活豬卵母細胞為研究對象，分析了早期卵裂、中期卵裂和晚期卵裂胚胎之間發(fā)育潛能的差異，發(fā)現(xiàn)相對早期發(fā)生卵裂的胚胎在體外培養(yǎng)過程中桑椹胚率和囊賠率更高,這一發(fā)現(xiàn)與以往早期卵裂與豬體細胞核移植胚胎發(fā)育相關性的研究相一致[10]。

通過對各組囊胚凋亡相關基因Bcl-2、Bax、P53進行檢測發(fā)現(xiàn)，在早期卵裂組凋亡相關基因Bax、P53的表達水平顯著低于中期和晚期卵裂組，而抗凋亡因子Bcl-2的表達更高，這表明早期卵裂組胚胎凋亡減少，胚胎的發(fā)育能力較高。Cyclin B1和Cdk作為細胞周期的重要調節(jié)因子參與細胞周期的調節(jié)，胚胎發(fā)育過程中必需Cyclin B1的參與，而胚胎早期分裂Cdk發(fā)揮重要的作用。在胚胎發(fā)育過程中Cyclin B1從細胞核轉移到質膜上形成CyclinB1-Cdk1，以阻止細胞進行有絲分裂而過早成熟。在Cyclin B1缺失的情況下，DNA復制后細胞停滯在G2期的四細胞期[11]。在發(fā)育不全的卵母細胞和胚胎中，母體細胞Cyclin B1和Cdk2表達水平均降低[12]。通過抑制Cdk 2活性能夠誘導胚胎DNA損傷，胚胎表現(xiàn)出延遲分裂并在囊胚期之前停止發(fā)育，所以Cdk 2通過直接或間接影響DNA修復相關基因的表達而發(fā)揮作用[13]。本研究結果表明，豬孤雌激活早期卵裂的胚胎囊胚中Cyclin B1、Cdk1 、Cdk2的表達水平更好，促使胚胎進入正常的有絲分裂，促進胚胎分裂和囊胚的形成，改善豬胚胎的早期發(fā)育。

胚胎發(fā)育過程是個復雜的、不斷變換的過程，應用TLI觀察胚胎的早期卵裂情況，確定早期卵裂的時間具有重要的意義。本次研究發(fā)現(xiàn)，孤雌激活豬卵母細胞初次卵裂較早的胚胎其發(fā)育潛能的更好，胚胎的桑椹胚率和囊胚率更高，能為輔助生殖技術選擇單個優(yōu)質囊胚提供依據(jù)，但對于臨床妊娠結局的影響還有待于進一步研究。