葛少欽王 然郭明申劉淑卓殷慧穎

1. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（保定 071000）; 2. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院; 3. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院

·研究簡報·

非梗阻性不育患者精子超微結(jié)構(gòu)的研究

葛少欽1王 然1郭明申2劉淑卓3殷慧穎1

1. 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（保定 071000）; 2. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院; 3. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院

當(dāng)今社會中不孕不育夫婦數(shù)量正逐步增加[1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界大約有15%～20%的育齡夫婦存在生育障礙，其中男性原因?qū)е虏挥谋壤?0%～50%[2]。

精子形態(tài)異常、精子畸形率增加是導(dǎo)致男性不育的重要原因[3]。近幾年來研究發(fā)現(xiàn)不育男性精子不僅存在光鏡形態(tài)學(xué)異常，而且精子的超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了病理性改變。鑒于諸多精子超微結(jié)構(gòu)研究過程中，存在精子超微結(jié)構(gòu)特征描述不系統(tǒng)、不同形態(tài)精子超微結(jié)構(gòu)描述不全面等問題，本文利用透射電鏡技術(shù)對臨床非梗阻性不育患者精液精子進(jìn)行觀察，努力發(fā)現(xiàn)患者不同形態(tài)精子超微結(jié)構(gòu)的細(xì)微缺陷，在精子超微結(jié)構(gòu)水平分析患者不育原因，預(yù)測男性潛在的生育能力，從而指導(dǎo)臨床診斷，為病人選擇最佳的治療方案[4]。

材料與方法

一、受試對象

受試對象為結(jié)婚2年，女方生殖系統(tǒng)功能正常，非梗阻性男性不育患者6例，按男性病實驗診斷標(biāo)準(zhǔn)檢測；正常對照組為結(jié)婚2年，孕育有孩子，正常生育男性3例。

二、標(biāo)本采集和處理

禁欲一周后，在室溫25～30℃的實驗室內(nèi)，由供精者按摩取精。待精液自動液化后，緩慢注入離心管中，以1 850×g，離心10min，用吸管輕輕吸出精漿，沉淀精子用瓊脂糖進(jìn)行預(yù)包埋，戊二醛固定液固定1h后，PBS緩沖液（pH=7.2）洗滌3次，每次10min，鋨酸固定1h，然后用Epon812環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片用甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下進(jìn)行半薄定位，切超薄切片用鉛鈾雙染，透射電鏡下觀察。

三、觀察指標(biāo)

透射電鏡下主要觀察精子的質(zhì)膜、頂體、精子核、精子頸部、線粒體和微管等病理性改變。

結(jié) 果

通過透射電鏡觀察，正常精子的質(zhì)膜和頂體雙層膜結(jié)構(gòu)完整清晰（圖1A、圖1B），精子核呈梨狀形，核染色質(zhì)電子密度均勻一致，尾部線粒體大小形態(tài)一致，排列規(guī)律（圖1C），精子尾部微管9+2結(jié)構(gòu)完好（圖1D）。

圖1 正常形態(tài)精子的超微結(jié)構(gòu)

在這6例男性不育患者的精液中幾乎都可見精子超微結(jié)構(gòu)不同程度的結(jié)構(gòu)異常，正常精子極其少見?；尉硬粌H僅是存在一種病變，大多數(shù)是多種結(jié)構(gòu)異常并存。

一、質(zhì)膜的異常

患者精子質(zhì)膜大多出現(xiàn)了病變，表面粗糙。質(zhì)膜邊緣可與頂體前膜融合變得模糊不清（圖2A），質(zhì)膜腫脹破損（圖2B），多處出現(xiàn)大小不等的囊泡（圖2C）甚至質(zhì)膜缺失（圖2D）等。

二、頂體的異常

有些精子頂體腫脹變形及產(chǎn)生褶皺，頂體雙層膜結(jié)構(gòu)可呈不平行或波浪狀改變（圖3A），外膜彎曲和不連貫，嚴(yán)重者頂體內(nèi)外層膜破損，內(nèi)容物溢出，有些頂體內(nèi)容物疏松呈低電子密度（圖3B），頂體后環(huán)部分缺失（圖3C），頂體邊緣卷曲，頂體下間隙增大，遠(yuǎn)離精子核（圖3D）等。

圖2 精子質(zhì)膜的異常

圖3 精子頂體的異常

三、精子核的異常

精子核異常的精子經(jīng)常表現(xiàn)為頭部形態(tài)的異常，在本例患者中錐形頭畸變精子居多（圖4A）。核濃縮異常，電子密度增高，核周出現(xiàn)囊性空泡，空泡與頂體內(nèi)膜相融合（圖4C），個別精子細(xì)胞核出現(xiàn)巨型空泡（圖4B），空泡間有膜性結(jié)構(gòu)（圖4D）。另外，在觀察到的未發(fā)育成熟精子中可見未分離的多核精子（圖5A）。

四、精子頸部的異常

頭部畸形的精子伴有頸部變形腫脹，存在胞質(zhì)小滴（圖5B）等。

五、線粒體的異常

多數(shù)精子可見其尾部軸絲兩側(cè)的線粒體數(shù)減少，線粒體分布不均，大小不一，疏密不均（圖3C、圖5C）；不育患者精子線粒體腫脹變形，嚴(yán)重腫脹的線粒體發(fā)生線粒體內(nèi)空泡化，形成微囊，囊內(nèi)可見高電子密度膜狀物（圖5D）；出現(xiàn)雙層或三層重疊線粒體圍繞于軸絲（圖6A、圖6B）等。

六、微管異常

尾部橫斷面見微管系統(tǒng)錯位，模糊不清，有些微管與纖維鞘融合呈高電子密度，軸絲異常2+9結(jié)構(gòu)紊亂異常，周圍微管或中央微觀有缺失（圖3B、圖6C、圖6D）等。

圖4 精子核的異常

圖5 精子核、頸部及線粒體的異常

圖6 精子線粒體、微觀的異常

討 論

通過電鏡與正常生育男性精液中精子的形態(tài)相比較，發(fā)現(xiàn)非梗阻性不育患者精液精子以錐形頭居多，且超微結(jié)構(gòu)幾乎都有不同程度的損傷，這與常規(guī)精液檢查中其精子畸形率偏高相一致。更值得注意的是，畸形精子不僅僅是存在一種病變，大多數(shù)是多種結(jié)構(gòu)異常并存，而發(fā)生單一病變者比較少見。精子結(jié)構(gòu)的正常是保證受孕的基礎(chǔ)，嚴(yán)重頭部畸形精子可導(dǎo)致低受精率、著床率和妊娠率[5]，精子超微結(jié)構(gòu)的異常與男性不育密不可分。精子的質(zhì)膜、頂體、精子核、線粒體、微管等任何一個結(jié)構(gòu)發(fā)生病變都將會影響受精。

完整的質(zhì)膜在把信息從精子外傳到精子內(nèi)的過程中，起著重要作用。一般認(rèn)為精子頭的前半部分精子膜參與頂體反應(yīng)，頂體后區(qū)的精子膜能識別卵子，并能與卵子的細(xì)胞膜相結(jié)合。電鏡下觀察到的質(zhì)膜的腫脹、破損、缺失等病變（圖2A～圖 2D），會影響精子受精。

頂體在受精過程中扮演著非常重要的角色，它是一種特化的溶酶體，內(nèi)含多種酶類如透明質(zhì)酸酶、乳酸脫氫酶等。當(dāng)精子和卵細(xì)胞相遇時頂體通過小孔釋放透明質(zhì)酸酶，降低宮頸黏液的黏度，使精子能穿透卵細(xì)胞的放射冠和透明帶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，完成受精過程[6]。在電鏡下觀察到不育男性患者的一些精子在頂體結(jié)構(gòu)方面受到嚴(yán)重?fù)p傷，精子頂體腫脹變形、內(nèi)外膜破損嚴(yán)重（圖3A、圖3B），會使酶系統(tǒng)受到抑制，頂體喪失了正常生理功能。另外還發(fā)現(xiàn)有的精子頂體后環(huán)有部分缺失（圖3C），頂體后環(huán)相應(yīng)部分的精子膜有識別卵細(xì)胞膜的功能，并與之相融合，缺乏頂體后環(huán)，即使精子與卵細(xì)胞相遇也達(dá)不到受精的目的，這可能是導(dǎo)致該男性不育的又一重要原因。

精子核是遺傳物質(zhì)的所在地，對受精卵的發(fā)育是非常重要的。在電鏡下可觀察到患者的精子核增長，錐形頭多見（圖4A）。盡管精子核增長的機制尚未闡明，研究人員認(rèn)為其有可能與染色體的異常，如染色質(zhì)凝聚狀態(tài)的改變、染色體的異倍性改變有關(guān)[7]。另外發(fā)現(xiàn)某些精子細(xì)胞核內(nèi)有空泡形成（圖4B～圖4D），核內(nèi)空泡是在染色質(zhì)濃縮過程中形成，一般不會影響精子的受精能力，但是我們在電鏡下發(fā)現(xiàn)病人精子核內(nèi)出現(xiàn)巨型空泡（圖4D），體積約占核的2/3，空泡體積增大可能是染色質(zhì)正常排列發(fā)生明顯畸變的結(jié)果，且被視為精子染色質(zhì)成熟度和濃縮異常[8]，可增加精子成熟障礙，影響精子的受精能力。

胞質(zhì)小滴是生殖細(xì)胞胞漿殘余物，大部分被睪丸支持細(xì)胞吞噬。在電鏡下可觀察到精子頸部腫脹，存有殘留物（圖5B）。過多殘留物的存在與精子的不成熟特別是活性氧的產(chǎn)生有關(guān)[9]，進(jìn)而導(dǎo)致精子DNA損傷、內(nèi)分泌激素異常和畸形精子的生成[10,11]，可導(dǎo)致精子功能下降，引起男性不育。

線粒體的功能是通過氧化磷酸化合成ATP，為精子的運動提供能量，在電鏡下可觀察到患者的精子的線粒體排列不均，大小不一，發(fā)生腫脹變形、空泡樣等病變（圖5C、圖5D、圖6A和圖6B）。當(dāng)精子線粒體發(fā)生異常后，將影響線粒體內(nèi)ATP能量的合成和線粒體自身復(fù)制的正確性，同時伴隨著各種能量代謝酶的改變，如琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶等含量的改變，導(dǎo)致精子能量正常供應(yīng)受影響，精子活動力減弱，進(jìn)一步影響精子的存活[12]，另有研究表明缺乏活動力的精子其受孕率僅21%[13]，因此認(rèn)為線粒體的異常是影響男性不育的主要原因之一。

微管通過肌動蛋白和肌球蛋白的滑動來操控精子尾部運動[14]，微管是精子運動的物質(zhì)基礎(chǔ)，可為精子提供動力，保證精子能順利到達(dá)受孕處。在電鏡下可觀察到不育患者的精子微管存在損傷、缺失，尾部橫斷面可以清晰可見9+2結(jié)構(gòu)有缺失，微管系統(tǒng)模糊不清（圖3B、圖6C圖和圖6D），這會導(dǎo)致精子運動能力不足，這也是男性不育的一個重要原因[15]。

總之，男性不育與精子的超微結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)，本實驗對非梗阻性男性不育患者精液進(jìn)行電鏡觀察，與正常生育男性精液進(jìn)行比較，結(jié)果顯示男性不育患者精子超微結(jié)構(gòu)存在多處病變，表明精子超微結(jié)構(gòu)異常系非梗阻性男性不育原因之一。

目前臨床不育檢查以精液常規(guī)檢查結(jié)果為主，在光鏡下觀察，僅對精子的形態(tài)進(jìn)行分類，只能對精子質(zhì)量有大致了解，通過電鏡的觀察，能了解精子內(nèi)部許多亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化與缺陷，可進(jìn)一步分析不育患者的成因，因此電鏡是目前精子形態(tài)學(xué)檢測最客觀可信的依據(jù)[16]。通過電鏡觀察精子的超微結(jié)構(gòu)，不僅有助于結(jié)束患者長期盲目的不育治療和檢查，提高臨床診斷和治療的水平，而且還能為精子內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化與男性生育力強弱間的關(guān)系提供基礎(chǔ)理論依據(jù)[17]。

男性不育; 精子/超微結(jié)構(gòu)

1 Marchesi DE, Feng HL. Sperm DNA integrity from sperm to egg.J Androl2007; 28(4): 481-489

2 朱健生, 季鋼, 張玲, 等. 卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)在男性不育癥中的臨床應(yīng)用. 中國優(yōu)生與遺傳雜志2008; 16(9): 106-107

3 Yu JJ, Xu YM. Ultrastructural defects of acrosome in infertile men.Arch Androl2004; 50(6): 405-409

4 王賀, 周亮, 石敏, 等. 不育男性精子形態(tài)與體外受精妊娠結(jié)局的相關(guān)性研究. 中國男科學(xué)雜志 2012; 26(1): 23-26

5 Lo Monte G, Murisier F, Piva I,et al. Focus on intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI): a mini-review.Asian J Androl2013; 15(5): 608-615

6 黃宇烽, 許瑞吉主編. 男科診斷學(xué). 上海第二軍醫(yī)大學(xué)出版社, 1999; 153-240

7 Siddighi S, Patton WC, Jacobson JD,et al. Correlation of sperm parameters with apoptosis assessed by dual f uorescence DNA integrity assay.Arch Androl2004; 50(4): 311-314

8 Celik-Ozenci C, Sahin Z, Ustunel I,et al. The Fas system may have a role in male reproduction.Fertil Steril2006; 85 Suppl 1: 1168-1178

9 Novotny J, Oborna I, Brezinova J,et al. The occurrence of reactive oxygen species in the semen of males from infertile couples.Biomed PaP Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub2003; 147(2): 173-176

10 Cooper TG. Cytoplasmic droplets: the good, the bad or just confusing.Hum Reprod2005; 20(1): 9-11

11 Rago V, Bilinska B, Palma A,et al. Evidence of aromatase localization in cytoplasmic droplet of human immature ejaculated spermatozoa.Folia Histochem Cytobiol2003; 41(1): 23-27

12 Allen JF. Separate sexes and the mitochondrial theory of aging.J Theor Biol1996; 180(2): 135-140

13 Nagy ZP, Verheyen G, Tournaye H,et al. Special applications of intracytoplasmic sperm injection: the inf uence of sperm count, motility, morphology, source and sperm antibody on the out come of ICSI.Hum Reprod1998; 13 Suppl 1: 143-154

14 Gopalkrishnan K, Padwal V, Dsouza S,et al. Severe asthenozoospermia: a structural and functional study.Int J

15 Chemes HE, Olmedo SB, Carrere C,et al. Ultrastructural pathology of the sperm f agellum: association between f agellar pathology and fertility prognosis in severely asthenozoospermic men.Hum Reprod1998; 13(9): 2521-2526

16 Baccetti B, Collodel G, Piomboni P. Apoptosis in human ejaculated sperm cells (notulae seminologicae 9).J Submicrosc Cytol Pathol1996; 28 (4 ): 587-596

17 Chemes HE. Phenotypes of sperm pathology: genetic and acquired forms in infertile men.J Androl2000; 21(6): 799-808

（2013-10-28收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.016

R 698.2