張雅君 盧 實劉 琳 王 珊 李璐璐 潘蘊蘇 高 穎

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院生殖中心（湖北武漢 430022）

無精子癥、重度少弱精子癥患者染色體核型與Y染色體微缺失發(fā)生率的研究*

張雅君 盧 實**劉 琳 王 珊 李璐璐 潘蘊蘇 高 穎

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院生殖中心（湖北武漢 430022）

目的探討染色體核型異常與男性無精子癥、重度少弱精子癥的關(guān)系。方法對2011年1月至2013年10月來我院生殖中心要求助孕的445例無精子癥、147例重度少弱精子癥患者，采用外周血常規(guī)染色體制備方法對染色體進行核型分析，并采用聚合酶鏈反應對122例Y染色體進行AZF微缺失檢測，283例不育癥患者進行睪丸/附睪穿刺取精檢查。結(jié)果445例無精子癥者檢出染色體核型異常率為38.65%，分別為性染色體異常22.7%，常染色體異常6.52%、染色體多態(tài)性9.43%；147例重度少弱精子癥者染色體異常率7.48%；與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。8例Y染色體AZF微缺失位點為AZFa（SY 84，SY 86），AZFb（SY 127，SY 134），AZFc（SY254，SY 255）。結(jié)論 無精子癥、重度少弱精子癥與染色體核型異常及Y 染色體微缺失密切相關(guān)，有必要在提供輔助生殖技術(shù)之前進行遺傳學檢查。

無精子癥; 少精子癥; 弱精子癥; 染色體, 人, Y; 性染色體畸變

男性不育是指未采取任何避孕措施有正常性生活1年以上，因男方因素女方未妊娠。全世界范圍內(nèi)約15%的夫婦不育不孕，其中50%與男方因素有關(guān)[1]。無精子癥和少弱精子癥是男性不育的主要原因之一，染色體遺傳因素異常能導致男性無精子癥或重度少弱精子癥[2]，Y染色體微缺失也與男性不育有一定關(guān)系[3]。國內(nèi)外文獻報道無精子癥中染色體異常率為12.5%～31%[4]，重度少弱精子癥中染色體異常率為1.1%～13.3%[5]。本研究旨在探討染色體核型、Y 染色體微缺失與無精子癥、重度少弱精子癥的關(guān)系。

資料和方法

一、一般資料

選擇2011年1月至2013年10月來我院生殖中心要求助孕的無精子癥患者445例和重度少弱精子癥患者147例，年齡24～50歲，平均年齡（32.76±5.23）歲；不育年限1～20年，平均（4.35±3.7）年。每名患者詳詢病史及生育史，排除外傷史和家族遺傳病史，排除女方不孕因素，經(jīng)皮睪丸穿刺精子抽吸術(shù)/經(jīng)皮附睪穿刺精子抽吸術(shù)（TESA/PESA）者穿刺之前行生殖器體格檢查。對照組為同期年齡相當、已有生育史或精液常規(guī)檢查正常的健康男性40例。

二、方法

（一）精液分析

排精后2～7d手淫法收集精液，手工精液分析參照世界衛(wèi)生組織（WHO）標準指南，所有病例均常規(guī)進行至少2次以上的精液分析檢查。鏡下檢查未見精子者的精液3000×g，離心15min沉淀后仍未發(fā)現(xiàn)精子者為無精子癥，并排除逆向射精；精子濃度＜5×106/mL為重度少精子癥，精子活動率a+b＜10%為重度弱精子癥。同時兼有兩項異常者，為嚴重少弱精子癥。

（二）染色體檢查

外周血染色體常規(guī)制備方法對染色體進行核型分析，G顯帶分析計數(shù)20個中期分裂象，分析5個細胞核型，異常核型則增加分析倍數(shù)，根據(jù)《人類細胞遺傳學國際命名體制》描述染色體異常核型。

（三）Y染色體微缺失檢測

從外周血淋巴細胞提取DNA，參考歐洲生殖協(xié)會（EAA）2004版指導原則和EMQN標準，選擇Y染色體微缺失6個位點設計引物，6個選擇位點分別是AZFa（SY 84，SY 86）、AZFb（SY 127，SY 134）和AZFc（SY 254，SY 255 ），以SRY的擴增作為PCR質(zhì)控對照，正常男性的DNA與患者DNA同時進行以上各位點的單重PCR擴增后電泳檢查PCR擴增產(chǎn)物。PCR試劑盒購自美國Omega公司。

（四）睪丸/附睪穿刺

會陰局部皮膚消毒，檢查睪丸尋找穿刺位點，用注射器連接7號頭皮針經(jīng)皮直接穿刺抽吸睪丸生精小管組織尋找活動精子；若一側(cè)睪丸穿刺取精失敗則檢查對側(cè)睪丸穿刺取精；以上均失敗則用注射器連接5號半頭皮針經(jīng)皮直接穿刺附睪組織飽滿處抽吸附睪液尋找活動精子。

（五）統(tǒng)計學方法

利用SPSS17.0軟件統(tǒng)計分析，使用四格表和行x列表的卡方檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、染色體異常核型檢出率及分布

445例無精子癥者檢出異常核型染色體172例（38.65%），分別為性染色體異常101例（22.7%）、其中克氏綜合癥有84例（18.88%），常染色體異常29例（6.52%），染色體多態(tài)性42例（9.43%），見表1。147例重度少弱精子癥者檢出異常核型染色體11例（7.48%），分別為性染色體異常2例（1.36%）、常染色體異常2例（1.36%）、染色體多態(tài)性7例（4.76%），見表2。40例對照組中檢出1例染色體多態(tài)性。3組間異常核型染色體檢出率有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

二、Y染色體微缺失

共檢查122例，其中：選擇男方染色體檢測為46,XY，無明確病因的無精子癥患者102例（均排除女方不孕因素），進行AZF微缺失檢查，發(fā)現(xiàn)有8例無精子癥患者的Y染色體分別在AZFa（SY 84，SY 86）、AZFb（SY 127，SY 134）或AZF c（SY 254，SY 255）有微缺失位；20例核型為46, XY的重度少弱精子未發(fā)現(xiàn)Y染色體微缺失。

三、梗阻性、非梗阻性無精子癥與染色體異常

445例無精子癥患者經(jīng)過體格檢查有283例進行睪丸或附睪穿刺。213例穿刺取出精子，其中染色體核型正常者204例（95.77%），染色體核型異常者9例（4.23%），分別為2例46XY,小Y、46XY, 22pstk+、46XY,15pstk+ 、46XY,15p+mar、46XY,9qh+、47XXY、46X,Yqh+和46XY,t（2; 21; 5）（p21; q11.2;q22）；70例穿刺未取出精子，其中染色體核型正常者51例（72.86%），染色體核型異常者19例（27.14%），分別為47,XXY 8例，47,XYY、46,XX、45XY, t（14;15）（q10;q10）、46X, del（Y）、46XY, del（13）（q31→qter）、46XY,Y染色體AZFc區(qū)微缺失、46XY, 16h+、46XY, 1qh+、46XY, Yqh-和2例46XY, 小Y。

表1 無精子癥患者染色體異常核型分類及分布

表2 重度少弱精子癥染色體異常核型分類及分布

討 論

染色體異常是引起男性生精功能障礙的重要原因，尤其是性染色體異常。本文中無精子癥患者異常核型染色體檢出率38.65%，顯著高于重度少弱精子癥患者的異常核型染色體檢出率7.48%和對照組的異常核型染色體率2.5%，并且無精子癥中染色體異常核型主要表現(xiàn)為性染色體異常，重度少弱精子癥者則主要表現(xiàn)為染色體多態(tài)性，結(jié)果表明染色體異常核型檢出率越高，精液質(zhì)量越差；性染色體異常是無精子癥的重要原因之一，染色體多態(tài)性會影響生精功能，這與其他一些文獻報導相符[6,7]。此外，睪丸/附睪穿刺取出精子的9例異常核型染色體中7例為染色體多態(tài)性，9例患者雙側(cè)睪丸平均體積為17mL；穿刺未取出精子的19例異常核型染色體中13例為性染色體或常染色體異常，19例患者雙側(cè)睪丸平均體積為13mL，這也表明與染色體多態(tài)性相比，性染色體異常、常染色體異常對男性不育的影響更嚴重。

克氏綜合征（klinefelter綜合征），又稱先天性曲細精管發(fā)育不全，是一種性染色體異常的先天性疾病，發(fā)病率在男性不育癥患者中占3.1%[8]，其最常見的核型是47, XXY，染色體核型特征是出現(xiàn)兩條或兩條以上的X染色體，多由異常的XX卵子與一個正常的Y精子結(jié)合，或由正常的X卵子與一個異常的XY精子結(jié)合產(chǎn)生，推測是卵子或精子發(fā)生減數(shù)分裂時染色體未分離，或早期受精卵在有絲分裂時染色體未分離，從而導致子代多出一條X染色體[9]。本文445例無精子癥患者中檢出84例47, XXY，占無精子癥患者的18.88%，顯著高于在男性不育癥患者中的發(fā)病率，分析原因可能是來本中心要求助孕的無精子癥患者人群過于集中，也并不是每一位男性不育癥患者都進行染色體檢測，有明確的其他原因諸如內(nèi)分泌異?；蛎庖咭蛩貙е碌牟挥Y患者沒有進行染色體檢查，從而出現(xiàn)克氏綜合征檢出率增高。本文中部分克氏綜合征患者的穿刺結(jié)果顯示鏡下可見支持細胞、間質(zhì)細胞，未見精原細胞、精母細胞、精子細胞及精子；超聲檢查雙側(cè)睪丸偏小，部分患者有附睪囊腫、睪丸微石癥或精索鞘膜積液等，顯現(xiàn)此類患者生精細胞的缺失及表型的異常。

Y染色體微缺失遺傳給男性子代的風險幾乎為100%[10]，進一步對Y染色體無精子因子AZF微缺失位點觀察發(fā)現(xiàn)：AZFc微缺失發(fā)生頻率較AZFa、AZFb高。本文中選擇的染色體正常的102例無精子癥患者有8例存在Y染色微缺失，其中AZFa 1例、AZFb 2例、AZFc 3例、AZFb+AZFc 2例，有2例AZFc微缺失患者睪丸穿刺檢查結(jié)果為生精小管內(nèi)未見各級生精細胞，超聲檢查也發(fā)現(xiàn)雙側(cè)睪丸體積稍小。Y染色體AZFa區(qū)微缺失表現(xiàn)以唯支持細胞綜合征，AZFb區(qū)微缺失表現(xiàn)為精子成熟障礙[11]， AZFc微缺失可殘留島狀的生精正常區(qū)域[12]；AZFc微缺失率較AZFa、AZFb高[13]。但本研究中20例重度少弱精子癥患者未發(fā)現(xiàn)Y染色體微缺失，可能是由于檢查例數(shù)較少、選擇的患者是46XY正常核型者而未能檢測到Y(jié)染色體微缺失，下一步需要檢測染色體核型異常的重度少弱精子癥患者的Y染色體微缺失；也不排除與以下因素有關(guān)：如位于3號常染色體的DAZLA基因缺失可造成隱性男性不育[14]；一些酶的異常也可造成AZF基因表達過程異常[15]，而未檢測到AZF微缺失。

綜上所述，無精子癥、重度少弱精與染色體核型密切相關(guān)，與Y染色體微缺失有一定關(guān)系，對于男性不育癥患者在提供輔助生殖技術(shù)之前進行染色體核型分析、Y染色體微缺失檢查是非常必要的。

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（2014-04-08收稿）

The frequency of chromosome abnormality and Yq microdeletions in infertile men with azoospermia or severe oligoasthenospermia*

Zhang Yajun, Lu Shi**, Liu Lin, Wang Shan, Li Lulu, Pan Yunsu, Gao Yin Reproductive Center of Union Hospital ,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan,
430022, Hubei, China

Lu Shi, Email: lushii@sina.com; Tel: 027-85351593

ObjectiveTo detect the frequency and types of chromosomal anomalies for infertile men with azoospermia and severe oligozoospermia.Methods445 cases of azoospermia and 147 cases of severe oligozoospermia patients in our reproductive center were recruited from January 2011 to October 2013. Karyotype analysis was performed in peripheral blood lymphocytes using standard G-banding. Y chromosome AZF microdeletions were detected using PCR . Testicular sperm retrieval puncture were done in 283 infertility men.ResultsThe frequency of chromosomal abnormalities of azoospermia patients was 38.65%, including sex chromosomes abnormalities (22.7%), autosomals abnormalities (6.52%) and chromosome polymorphism abnormalities (9.43%). The frequency of chromosomal abnormalities of serve oligozoospermia patients was 7.48%. Both abnormal chromosome rates of azoospermia and severe oligoasthenospermia group were signif cant differences compared with that of the control group (P<0.01). Eight cases of AZF microdeletions sites were AZFa(SY 84 SY 86)，AZFb(SY 127 SY 134)，AZFc(SY254 SY 255).ConclusionChromosome analysis is a necessary routine genetic testing, chromosome anomalies and Yq microdeletions may be associated with azoospermia and severe oligozoospermia in infertile men.

azoospermia; oligospermia; asthenozoospermia; chromosomes, human, Y; sex chromosome aberrations

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.011

R 698.2

資助: 國家“十二五科技支撐”計劃（2012BAI32B03）; 武漢市人口和計劃生育科研計劃（2009WRJK0909）
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, E-mail: lushii@sina.com; Tel: 027-85351593