周 波 孫中義靳風(fēng)爍 李彥鋒 張 軍 張克勤第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科（重慶 400042）

·論 著·

小鼠Bin1b真核表達(dá)載體pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b構(gòu)建及在真核細(xì)胞HEK293中的表達(dá)*

周 波 孫中義**靳風(fēng)爍 李彥鋒 張 軍 張克勤
第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科（重慶 400042）

目的構(gòu)建表達(dá)小鼠抗菌肽蛋白（Bin1b）的真核表達(dá)載體pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b，對(duì)其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析。方法應(yīng)用PCR方法獲得Bin1b的cDNA片斷，將其插入pSG.SS.C3d3.YL中，經(jīng)酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用間接免疫熒光結(jié)合激光共聚焦技術(shù)、Western blot技術(shù)、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)對(duì)Bin1b的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果構(gòu)建成功后的pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b在HEK293細(xì)胞中能夠表達(dá)Bin1b。 結(jié)論 Bin1b在真核細(xì)胞中的成功表達(dá)為后續(xù)研究Bin1b的高表達(dá)對(duì)受精過程的影響奠定了基礎(chǔ)。

真核細(xì)胞; 遺傳載體; 基因表達(dá); 熒光抗體技術(shù), 間接

附睪對(duì)精子成熟、儲(chǔ)存和保護(hù)的作用因具有以下兩個(gè)最重要的特點(diǎn)而早已經(jīng)被認(rèn)同，并被視為進(jìn)行抗生育的一個(gè)理想的靶器官[1,2]。這兩個(gè)特點(diǎn)一是功能較為單一，干擾功能的藥物不致引起嚴(yán)重的副作用。二是精子在進(jìn)入附睪前已經(jīng)分化完全，基因轉(zhuǎn)錄已經(jīng)停止，其成熟功能的獲得一般與蛋白質(zhì)修飾有關(guān)，不涉及DNA復(fù)制機(jī)能，因此干擾藥物不會(huì)引起DNA改變的遺傳病?？咕牡鞍祝˙in1b，或SPAG11）自附睪頭部中段的上皮細(xì)胞中分泌入管腔后與還沒有運(yùn)動(dòng)能力的精子結(jié)合，通過L型鈣離子通道使精子攝取鈣離子，“起始”精子運(yùn)動(dòng)[3,4]。因此，Bin1b極有可能成為免疫節(jié)育疫苗的理想靶抗原。上個(gè)世紀(jì)90年代后期發(fā)現(xiàn)2或3個(gè)串聯(lián)的補(bǔ)體C3裂解片段C3d具有強(qiáng)烈的免疫佐劑效應(yīng)，可大大提高抗原的免疫原性[5]。因此本研究利用了補(bǔ)體領(lǐng)域的這一重要發(fā)現(xiàn)，以Bin1b作為研究目標(biāo)，引入C3d作為分子內(nèi)佐劑，制備含有Bin1b和串聯(lián)的3個(gè)C3d（C3d3）融合基因的真核重組表達(dá)載體pSG.SS.C3d3. YL-Bin1b，并對(duì)其在真核細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行鑒定。

材料與方法

一、菌種、質(zhì)粒和試劑

大腸桿菌DH5α為本室保存菌種、含Bin1b基因編碼序列的重組載體pYA3149-Bin1b由李彥鋒博士惠贈(zèng)，空載體pSG.SS.YL和pSG.SS.C3d3.YL由梁培禾博士惠贈(zèng)。HEK293細(xì)胞和Raji細(xì)胞購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。分子生物學(xué)操作所用工具酶購自日本TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自美國Omega公司，胰蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxford公司，瓊脂粉、瓊脂糖等購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司，DMEM購自美國Gibco公司，引物由上海鼎安生物科技有限公司合成，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司?？笲in1b羊抗多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司（SPAG11A/ B， K-13，sc-103236），SP9000免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗羊IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。

二、方法

（一）引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Bin1b 結(jié)構(gòu)將引物設(shè)計(jì)為：Forward primer：TGCACAGAGAGCGAGCCGTA，Reverse primer：ATGCACCGTCAGCCACACAT，所對(duì)應(yīng)的堿基為第35至第370bp，目的條帶為336bp。在以上引物前端分別添加限制性內(nèi)切酶BglⅡ（AGATCT）和BamHⅠ識(shí)別序列（GGATCC），并添加保護(hù)性堿基各2個(gè)（GA和CG），得以下結(jié)果：Forward primer：5’-GAAGA TCTTGCACAGAGAGCGAGCCGTA-3’ （插入BglⅡ酶切位點(diǎn)）；Reverse primer：5’-CGGGATCCATGC ACCGTCAGCCACACAT-3’ （插入BamHⅠ酶切位點(diǎn)）；如此所得的目的條帶為336+6+2+6+2=352 bp。

（二）Bin1b基因擴(kuò)增和重組載體pSG.SS.C3d3. YL-Bin1b的構(gòu)建

以pYA3149-Bin1b為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)（94℃30s，55℃ 30s，72℃ 60s共30個(gè)循環(huán)）獲得352bp大小的目的片段。BglⅡ分別酶切PCR產(chǎn)物和pSG. SS.C3d3.YL，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收，對(duì)回收產(chǎn)物分別用BamHⅠ進(jìn)行再酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物后，紫外燈下分別切割含目的片段和載體的凝膠，膠回收試劑盒進(jìn)行回收。T4 DNA連接酶連接膠回收產(chǎn)物（16℃，1h）并轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至DH5α，挑取單菌落進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增。用BglⅡ和BamHⅠ雙酶切鑒定正確后的重組質(zhì)粒命名為pSG. SS.C3d3.YL-Bin1b。

（三）pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞

按2×105細(xì)胞/孔接種人胚腎HEK293細(xì)胞至鋪有蓋玻片的六孔板中，待細(xì)胞長至90%融合時(shí)以空載體pSG.SS.C3d3.YL為對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體方法為：（1）將10μg DNA用250μL無抗無血清DMEM稀釋并混勻后，室溫孵育5min；（2）用240μL無抗無血清DMEM稀釋10μL Lipofectamine 2 000并混勻后，室溫孵育5min；（3）將以上（1）和（2）中混合液進(jìn)行混和即成轉(zhuǎn)染混合液，室溫孵育15min；（4）將六孔板中培養(yǎng)液換用1mL無抗無血清DMEM，加入轉(zhuǎn)染混合液，并輕柔混勻，置于CO2培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）孵育；（5）4h后，棄去培養(yǎng)液，換用含10%小牛血清之DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

（四）Bin1b表達(dá)的間接免疫熒光檢測(cè)

轉(zhuǎn)染完成48h后，取出蓋玻片，冰丙酮固定5min，根據(jù)SP9000試劑盒進(jìn)行酶修復(fù)與抗原封閉，加入Bin1b抗體（1:400），孵育40min，PBS洗去抗體，加入FITC標(biāo)記的抗羊IgG（1:500稀釋）室溫孵育30min，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

（五）Western blot 鑒定

收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心后裝入透析袋，置于PEG6000固體中，將上清液濃縮50倍，利用紫外分光光度法進(jìn)行蛋白定量，并用上樣緩沖液稀釋至2500μg/mL后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。首先灌制聚丙烯凝膠，灌藥時(shí)先灌下層的分離膠，再灌上層的濃縮膠，然后再上樣（每孔50ug/20μL）進(jìn)行蛋白電泳（電壓濃縮膠為90V，分離膠為140V）。電泳結(jié)束后，進(jìn)行PVDF膜電轉(zhuǎn)，100V恒壓電轉(zhuǎn)1h，移入4℃冰箱20V電轉(zhuǎn)過夜。取出PVDF 膜，放入加有封閉液的密封塑料袋中，室溫?fù)u動(dòng)4 h。洗膜后加入Bin1b抗體（1:400），室溫?fù)u動(dòng)1h，加入二抗（HRP標(biāo)記抗羊IgG，1:1000稀釋），室溫?fù)u動(dòng)1h，洗膜后顯影；將PVDF 膜置于NEN化學(xué)發(fā)光試劑中反應(yīng)1～3min；在暗室中使X 光片曝光，常規(guī)方法顯影和定影。

（六）免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定

蓋玻片多聚賴氨酸包被后置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后將處于對(duì)數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞接種于其中，同前進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)過程中，細(xì)胞爬附于蓋玻片上。 冷丙酮固定5～10min，0.3% H2O2甲醇溶液（新鮮配制）室溫浸泡30min。5ml/L Triton-X 100 在4℃條件下通透細(xì)胞膜2min。 正常山羊血清室溫下封閉20min，甩去多余液體。 滴加一抗（1:500），室溫孵育40min，滴加二抗（HRP標(biāo)記抗羊IgG，1:400稀釋），37℃孵育0.5 h。DAB顯色。蘇木素復(fù)染10s，鹽酸酒精分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)明確棕黃色顆粒判定為陽性，照相記錄。

（七）流式細(xì)胞儀鑒定

Raji 細(xì)胞膜上具有豐富的 CD21分子（C3d 受體），把其與不同表達(dá)產(chǎn)物共孵育，間接免疫熒光染色標(biāo)記Bin1b抗原，只有當(dāng)Bin1b與C3d3為融合蛋白時(shí)，才能使Raji 細(xì)胞熒光標(biāo)記為陽性，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定陽性細(xì)胞比例。具體方法如下：獲取不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清，各取150μL與Raji細(xì)胞37℃孵育1h。PBS漂洗后滴加一抗，500μL重懸細(xì)胞，室溫孵育45min。 PBS漂洗后滴加二抗（FITC標(biāo)記抗羊IgG，1:200稀釋）重懸細(xì)胞，室溫孵育45min。PBS重懸細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

結(jié) 果

一、PCR法獲得Bin1b基因

利用PCR法，成功獲取了約352bp的目的片段，酶切后結(jié)果見圖1。

二、重組載體pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b的鑒定

為鑒定構(gòu)建的重組載體是否正確，對(duì)提取后的質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b用BglⅡ和BamHⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定。0.8%瓊脂糖凝膠電泳酶切結(jié)果（圖2）顯示，近352bp處的條帶為酶切后的目的片段，測(cè)序結(jié)果也顯示該片段為Bin1b編碼基因，表明pSG. SS.C3d3.YL-Bin1b構(gòu)建成功。

三、重組載體pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b表達(dá)檢測(cè)

以pSG.SS.C3d3.YL空載體的免疫熒光結(jié)果為陰性相比，pSG.SS.YL-Bin1b和pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b的表達(dá)結(jié)果顯示大量目的蛋白表達(dá)于胞漿和胞核中，表明真核細(xì)胞中Bin1b 表達(dá)成功，見圖3。

四、Western blot檢測(cè)結(jié)果

質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b及pSG.SS.YL-Bin1b轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)顯示細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在分子量分別為116kD及6 kD分子量的表達(dá)產(chǎn)物，與Bin1b-C3d3融合蛋白及Bin1b蛋白理論分子量（5.8KD）接近；質(zhì)粒pSG.SS.YL轉(zhuǎn)染后無可與抗Bin1b抗體結(jié)合的蛋白產(chǎn)物表達(dá)，見圖4。

圖1 Bin1b PCR產(chǎn)物經(jīng)BglⅡ和BamHⅠ酶切電泳結(jié)果

圖2 pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b和pSG.SS.YL-Bin1b酶切鑒定電泳結(jié)果

圖3 不同Bin1b重組載體蛋白表達(dá)熒光檢測(cè)結(jié)果

圖4 不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后培養(yǎng)上清中表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析

五、免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Bin1b表達(dá)，pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b為強(qiáng)陽性，pSG.SS.YL-Bin1b為陽性，見圖5。

六、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

重組質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b、pSG.SS.YLBin1b及pSG.SS.YL轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與不同培養(yǎng)上清共孵育后的Raji細(xì)胞表面Bin1b抗原存在情況，顯示前者熒光標(biāo)記陽性細(xì)胞比例高達(dá)89.2%，而后兩者僅為8.5%和3.5%（圖6），說明重組質(zhì)?？杀磉_(dá)融合蛋白，且其中Bin1b可被相應(yīng)抗體識(shí)別，而C3d與其受體結(jié)合的功能也未受到影響。

討 論

圖5 轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后Bin1b免疫細(xì)胞化學(xué)分析 ×200

圖6 Raji細(xì)胞表面 Bin1b抗原流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

目前雖然國內(nèi)外已有多種方式用于控制生育，但仍缺乏能為兩性所普遍接受的理想避孕措施，因而開發(fā)新的安全、高效、方便、廉價(jià)、可逆的避孕方法仍是當(dāng)前生殖與避孕研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)問題之一。目前世界上所采用的避孕措施主要以女性為主，有關(guān)避孕藥物還不完善，有致畸、肝臟毒性等副作用，其遺傳后果還有待進(jìn)一步評(píng)估。男性主動(dòng)參與避孕將很好促進(jìn)男女平等和社會(huì)進(jìn)步[6]，目前可供男性選擇的避孕措施中雄性免疫避孕疫苗更具有重要意義[7]。

睪丸和附睪受到生理屏障保護(hù)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)不識(shí)別自身的睪丸和附睪蛋白。當(dāng)這些蛋白進(jìn)入血液中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)就因?yàn)閺膩矶疾徽J(rèn)識(shí)這種物質(zhì)而把它們當(dāng)成外來入侵者，從而產(chǎn)生抗體以消滅和阻截它們。Bin1b自附睪頭部中段的上皮細(xì)胞中分泌入管腔后與還沒有運(yùn)動(dòng)能力的精子結(jié)合，通過L型鈣離子通道使精子攝取鈣離子，“起始”精子運(yùn)動(dòng)。張永蓮院士將附睪頭部未成熟的精子和附睪頭部上皮細(xì)胞（含Bin1b）或轉(zhuǎn)染了Bin1b的小腸上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)精子的運(yùn)動(dòng)，但加入Bin1b的抗體后則無此效果；他們還在從附睪尾部取得的成熟精子中加入Bin1b的抗體，結(jié)果顯示精子的活動(dòng)能力受影響不大。說明Bin1b能啟動(dòng)未成熟精子的運(yùn)動(dòng)能力，但對(duì)維持成熟精子的活動(dòng)不起主要作用[8]。研究還排除了附睪頭部其他分泌因子參與未成熟精子前向運(yùn)動(dòng)能力的獲得，將Bin1b的cDNA轉(zhuǎn)染到結(jié)腸上皮細(xì)胞系T84，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Bin1b的Bin-T84細(xì)胞系和空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照組Vet-T84細(xì)胞系，然后同樣將兩者與不游動(dòng)的未成熟精子共培養(yǎng)?？梢园l(fā)現(xiàn)在精子運(yùn)動(dòng)力增加、前向運(yùn)動(dòng)百分比增加和這些時(shí)相分布上，Bin-T84細(xì)胞與精子共培養(yǎng)和附睪頭部細(xì)胞與精子共培養(yǎng)相似，相對(duì)照的Vet-T84細(xì)胞精子共培養(yǎng)則沒有顯著增加。因此Bin1b參與了精子成熟中未成熟精子開始獲得前向力這一關(guān)鍵點(diǎn)[8]。

C3d 與B 細(xì)胞和濾泡樹突狀細(xì)胞（FDC）上的受體（CR2 ,CD21）的相互作用對(duì)于正常體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和維持至關(guān)重要。自從1996 年Thornton 等[9]報(bào)道C3d 是一個(gè)能顯著增強(qiáng)體液免疫效力的分子佐劑以來，此后許多研究相繼證實(shí)C3d 是具有巨大潛能的疫苗佐劑。分子佐劑C3d 通過與抗原分子的偶聯(lián)，能夠提高抗原的免疫原性，降低B 細(xì)胞的活化閾值，增強(qiáng)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度[10]。

基于目前的研究現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建了能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)的重組載體pSG.SS.C3d3.YLBin1b，結(jié)果證實(shí)構(gòu)建成功。正確的堿基序列是DNA疫苗接種后能正確表達(dá)并發(fā)揮作用的關(guān)鍵，對(duì)轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾等方面更具有重要意義。因此，應(yīng)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物加以分析驗(yàn)證，Western blot結(jié)果顯示可見有116kD的條帶，符合Bin1b-C3d3融合蛋白的理論分子量值。用抗Bin1b的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，無論是直接檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，還是先將表達(dá)產(chǎn)物與存在C3d受體的Raji 細(xì)胞共孵育后再進(jìn)行檢測(cè)，均為陽性反應(yīng)，說明無論單體還是融合蛋白中Bin1b部分免疫識(shí)別表位保持良好，而C3d部分也未因與Bin1b的耦聯(lián)而喪失其與受體結(jié)合的生物學(xué)活性，表明該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后能夠正確表達(dá)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建的pSG.SS.C3d3.YLBin1b能夠在真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，為后續(xù)研究Bin1b的高表達(dá)對(duì)受精過程的影響奠定了基礎(chǔ)。

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（2014-07-15收稿）

Construction of eukaryotic recombinant plasmid pSG.SS.C3d3.YLBin1b and its expression in HEK293 cells*

Zhou Bo, Sun Zhongyi**, Jin Fengshuo, Li Yanfeng, Zhang Jun, Zhang Keqin
Department of Urology, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University,
Chongqing 400042, China

Sun Zhongyi, sun200801@hotmail.com; Tel: 023-68757946

ObjectiveTo construct the eukaryotic recombinant plasmid pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b and detect its expression in HEK293 cells.MethodsThe cDNA fragment of gene Bin1b was f rst produced by PCR, then inserted into the eukaryotic plasmid pSG.SS.C3d3.YL to form recombinant plasmid pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b. After the recombinant plasmid was conf rmed by restriction enzymes digestion analysis and sequence, it was transfected into HEK293 cells to express the target protein Bin1b. The expression of Bin1b was detected by immunof uorescence, Western blot, immunohistochemistry staining, and flow cytometry assay, respectively.ResultsThe transfected recombinant vector pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b expressed Bin1b protein in HEK293 cells.ConclusionThe successful expression of Bin1b in eukaryotic cells will establish a solid base for exploring the effect of high expression of Bin1b on the fertilization process.

eukaryotic cells; genetic vectors; gene expression; f uorescent antibody technique, indirect

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.001

R392

資助: 國家自然科學(xué)基金（81100546）; 重慶市自然科學(xué)基金（CSTC，2010BB5162）資助
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, E-mail: sun200801@hotmail.com; Tel: 023-68757946