黃曉雯，馮笑軍

（廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510075）

焦糖是一種在食品中應(yīng)用范圍十分廣泛的天然著色劑，其主要是用飴糖、蔗糖、葡萄糖等熬成的黏稠液體或粉末，深褐色，有苦味，主要用于醬油、糖果、醋、啤酒等的著色。其中醬油專用焦糖為耐鹽焦糖，相當(dāng)于國(guó)際III類焦糖。一般認(rèn)為，焦糖反應(yīng)有兩種類型：一類是在有胺伴隨下的美德拉反應(yīng)，另一類是在相當(dāng)高的溫度（大約200℃）發(fā)生的純焦糖化反應(yīng)（單純地加熱葡萄糖的焦化反應(yīng)）。這2種劇烈反應(yīng)均會(huì)生成5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）和糠醛（furfural）[1]。這2種物質(zhì)具備增香調(diào)色功能，參與生成多種香味物質(zhì)和深色物質(zhì)。5-HMF和糠醛若達(dá)到一定的劑量時(shí)可對(duì)人體產(chǎn)生危害。研究表明，一定劑量的糠醛或5-HMF 被機(jī)體吸收后，會(huì)對(duì)呼吸道、肝臟、腎臟、心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等器官產(chǎn)生不良影響；5-HMF還會(huì)造成動(dòng)物橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害[2-3]。

目前，我國(guó)僅有GB/T 18932.18—2003《蜂蜜中羥甲基糠醛含量的測(cè)定方法液相色譜一紫外檢測(cè)法》[4]有關(guān)于5-HMF的檢測(cè)方法，還沒(méi)有關(guān)于廣泛食品中的5-HMF和糠醛的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。國(guó)內(nèi)研究文獻(xiàn)多數(shù)使用液相色譜法[2-10]檢測(cè)，少量報(bào)道使用氣相色譜（gas chromatogram，GC）[11]、氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS）[12]和液質(zhì)聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC/MS）[13-15]進(jìn)行檢測(cè)。在食品領(lǐng)域的檢測(cè)對(duì)象主要集中在蜂產(chǎn)品[4，7]、酒類[3，5，8]等。提取的手段主要使用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取[2-4，8，12]。未見(jiàn)有關(guān)于焦糖中5-HMF和糠醛檢測(cè)的研究報(bào)道。

本研究旨在建立醬油專用焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛含量的分析方法，用于分析2種物質(zhì)在焦糖中的含量情況，為分析焦糖添加到醬油后5-羥甲基糠醛和糠醛含量變化以及2種物質(zhì)對(duì)增香物質(zhì)的產(chǎn)生作用提供數(shù)據(jù)參考。該方法采用親水親脂平衡的水可浸潤(rùn)性反相吸附劑固相萃取柱對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的焦糖樣品進(jìn)行萃取凈化，能有效清除焦糖中的極性雜質(zhì)干擾。結(jié)合優(yōu)化的液相色譜分離條件，5-羥甲基糠醛和糠醛獲得良好的分離效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油專用焦糖：市售；糠醛標(biāo)準(zhǔn)品（99%）、5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國(guó)TEDIA公司；OASIS WAX固相萃取柱：美國(guó)Waters 公司；本實(shí)驗(yàn)所用的水為超純水。

固相萃取柱：Oasis HLB，500mg，6mL，使用時(shí)依次加入3mL水、3mL甲醇和3mL水活化。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance2695/2487高效液相色譜儀配紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司；Bs210s天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；MS3渦旋振蕩儀：廣州科儀實(shí)驗(yàn)室技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確稱取5-羥甲基糠醛和糠醛各25.00mg，用3mL甲醇溶解，用純水定容至25mL。所得溶液質(zhì)量濃度均為1mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)工作液使用純水稀釋成適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：SymmetryShield RP18（250mm×4.6mm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相為A：水，B：乙腈；洗脫方式：梯度；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度Table 1 Gradient table of the mobile phase

1.3.3 樣品處理

稱取焦糖樣品0.200g，用水稀釋定容至10mL。準(zhǔn)確吸取5mL稀釋液至活化好的親水親油平衡（hydrophilelipophile balance，HLB）柱上，用6mL水清洗，抽真空直到柱子里面的水被抽干，加入5mL甲醇進(jìn)行洗脫，補(bǔ)加甲醇定容至5mL。靜置1h后準(zhǔn)確吸取上清液和純水各1mL，渦旋30s，過(guò)0.45μm濾膜，上機(jī)待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱是利用固體吸附劑將樣品中的目標(biāo)化合物吸附，利用不同物質(zhì)的極性差異使目標(biāo)化合物與基體干擾物分離，再用洗脫液淋洗達(dá)到分離和富集的目的。根據(jù)5-羥甲基糠醛和糠醛的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，比較了OASIS HLB 固相萃取柱、C18固相萃取柱和聚合物陽(yáng)離子交換（polymer cation exchange，PCX）固相萃取柱等的凈化效果。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普通C18固相萃取柱由于中間步驟有抽干水的原因，因此對(duì)目標(biāo)物的保留和洗脫效果均不理想；而HLB和PCX柱有聚合物吸附劑，可以抵抗干涸帶來(lái)的吸附能力的影響。在對(duì)HLB柱和PCX柱進(jìn)行一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液試驗(yàn)結(jié)果表明，使用HLB柱進(jìn)行凈化，5-羥甲基糠醛和糠醛均有90%以上的回收率（見(jiàn)圖1）；而PCX柱2種目標(biāo)物質(zhì)均只有80%左右的回收率。因此，選擇HLB柱作為本方法固相萃取使用柱。

圖1 5-HMF和糠醛在HLB柱上的回收率曲線圖Fig.1 Recovery curve of 5-HMF and furfural in HLB cartridge

2.1.2 固相萃取柱凈化條件優(yōu)化

針對(duì)固相萃取中的清洗步驟，實(shí)驗(yàn)使用純水、5%和10%體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液分別進(jìn)行清洗，測(cè)試清洗液中5-羥甲基糠醛和糠醛的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5%和10%體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液都會(huì)不同程度洗脫出5-羥甲基糠醛，而純水沒(méi)有。因此選擇純水作為清洗溶液。針對(duì)固相萃取洗脫步驟，分別選用丙酮、乙腈、甲醇作洗脫溶劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種溶劑都能將5-羥甲基糠醛洗脫下來(lái)，但對(duì)糠醛的洗脫能力有區(qū)別：丙酮＜乙腈＜甲醇。同時(shí)，使用甲醇做洗脫劑能使樣品雜質(zhì)沉淀較多而不影響5-羥甲基糠醛和糠醛在洗脫液中的含量，因此選擇甲醇作為洗脫劑。

優(yōu)化后所得固相萃取純化條件為使用OASIS HLB柱，上樣體積為5mL、10mL 純水洗雜質(zhì)、5mL甲醇洗脫。圖2和圖3分別為焦糖樣品使用HLB柱凈化前和后的效果圖。從圖2可知，HLB固相萃取柱能較好地清除樣品中的雜質(zhì)，并減少對(duì)5-羥甲基糠醛和糠醛的干擾。

2.2 流動(dòng)相的選擇

以水+乙腈、水+甲醇2種流動(dòng)相體系、采用梯度洗脫和等度洗脫4種條件來(lái)對(duì)流動(dòng)相條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，使用水+乙腈，采用梯度洗脫能使2種物質(zhì)獲得良好的峰形，結(jié)果見(jiàn)圖4。而且利用梯度洗脫讓強(qiáng)極性雜質(zhì)先洗脫出來(lái)，減少基質(zhì)干擾影響，從而能獲得良好的分離度。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

在200～300nm范圍內(nèi)對(duì)5-羥甲基糠醛和糠醛進(jìn)行紫外光譜掃描，5-羥甲基糠醛在波長(zhǎng)275nm處有最大吸收；糠醛在波長(zhǎng)284nm處有最大吸收。為了能同時(shí)檢測(cè)5-羥甲基糠醛和糠醛并讓2種物質(zhì)同時(shí)獲得較好的響應(yīng)值，取280nm作為2種物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 焦糖樣品未使用HLB柱凈化前的色譜圖Fig.2 Chromatogram of caramel sample not purified by HLB cartridge

圖3 焦糖樣品使用HLB柱凈化后的色譜圖Fig.3 Chromatogram of caramel sample purified by HLB cartridge

圖4 5-羥甲基糠醛和糠醛的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.4 Chromatogram of furfural and 5-HMF standard solution

2.4 方法的線性范圍和檢出限

用5-羥甲基糠醛和糠醛混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液100μg/mL分別配制質(zhì)量濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、10.0μg/mL、30.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，在本儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，線性方程、線性相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

從表2可知，2種物質(zhì)在0.5～100μg/mL范圍內(nèi)均獲得良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999。按信噪比S/N=3計(jì)算5-羥甲基糠醛和糠醛的儀器檢出限分別為0.39ng/mL和0.41ng/mL，然后按照本實(shí)驗(yàn)方法操作，本方法的最低檢出限（limit of detection，LOD）為：5-羥甲基糠醛0.039mg/kg，糠醛0.041mg/kg。

表2 5-羥甲基糠醛和糠醛的線性方程、相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations,R2 of 5-HMF and furfural

2.5 精密度和回收率

平行稱取18份相同醬油專用焦糖的樣品，并向樣品添加一定量的5-羥甲基糠醛和糠醛混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法處理測(cè)定，使用外標(biāo)法定量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。5-羥甲基糠醛和糠醛的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在2.5%～4.6%之間，加標(biāo)回收率在87.1%～99.2%之間，精密度和回收率均滿足方法學(xué)定量要求。

表3 精密度與加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Table 3 Results of precision and recovery rate test

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

使用本方法對(duì)以不同的糖為原料，使用不同工藝方法制成的焦糖進(jìn)行5-羥甲基糠醛和糠醛含量檢測(cè)，分析結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 不同原料和加工方法的焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛含量Table 4 Content of 5-HMF and furfural in caramel obtained by different materials and processing methods

從表4可知，相同原料和工藝的不同焦糖中，5-羥甲基糠醛和糠醛的含量變化比較大；相同原料不同工藝的焦糖所含的5-羥甲基糠醛和糠醛含量相差也很大。以同一種糖為原料，使用方法2生產(chǎn)的焦糖相對(duì)使用方法1和方法3生產(chǎn)的焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛較低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，不同的原料和加工方法會(huì)對(duì)焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛的生成有影響作用，其影響程度和生成機(jī)理以及對(duì)醬油的影響仍需進(jìn)一步研究探討。

3 結(jié)論

采用親水親脂平衡的水可浸潤(rùn)性反相吸附劑固相萃取柱OASIS HLB對(duì)醬油專用焦糖進(jìn)行凈化，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，建立了定量測(cè)定醬油專用焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛的含量方法。本方法在0.5～100μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2＞0.999，RSD（n=6）在2.5%～4.6%之間，加標(biāo)回收率在87.1%～99.2%之間，5-羥甲基糠醛和糠醛的方法檢出限（LOD）分別為0.039mg/kg和0.041mg/kg。方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明其具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、干擾雜質(zhì)少的特點(diǎn)，能滿足企業(yè)對(duì)原料進(jìn)行檢測(cè)監(jiān)控的需要。為分析原料和加工方法對(duì)焦糖中5-羥甲基糠醛和糠醛含量的影響以及對(duì)添加到醬油后的影響和芳香物質(zhì)的變化的研究提供可靠的試驗(yàn)方法和研究數(shù)據(jù)。

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