吳朝朝，劉 華，趙 利 *，江 勇，袁美蘭，陳麗麗

（1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330029；2.江西科技師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013；3.國(guó)家淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)分中心（南昌），江西 南昌 330013）

魚(yú)露又稱魚(yú)醬油，其營(yíng)養(yǎng)豐富，味道獨(dú)特，是我國(guó)沿海一帶及日本、東南亞各國(guó)人民傳統(tǒng)的調(diào)味品[1-2]。過(guò)去絕大部分的魚(yú)露是以海水魚(yú)[3-4]為材料制造而成的，因此對(duì)魚(yú)露營(yíng)養(yǎng)成分和食用口味的研究范圍有限。近年來(lái)，不少學(xué)者也開(kāi)始專注于利用淡水魚(yú)[5]如鰱魚(yú)[6-7]、羅非魚(yú)[7-8]等的下腳料[9-10]進(jìn)行魚(yú)露加工的研究。由于淡水魚(yú)加工產(chǎn)生大量下腳料，且通常僅粗加工成飼料或者直接廢棄掉，未得到充分的利用，因此利用淡水魚(yú)的下腳料加工魚(yú)露不僅體現(xiàn)了節(jié)約資源、充分利用的環(huán)保理念，也使得開(kāi)發(fā)高質(zhì)量、低成本的魚(yú)露成為可能[9]，且對(duì)提高淡水魚(yú)的利用價(jià)值具有重要意義[11]。淡水魚(yú)的下腳料尤其是肝臟、魚(yú)頭中因含有豐富的內(nèi)源性蛋白酶，可通過(guò)下腳料自身蛋白酶的水解作用將蛋白質(zhì)水解為氨基酸和多肽，因此研究淡水魚(yú)類下腳料的自溶水解[12]對(duì)利用其開(kāi)發(fā)魚(yú)露制品很有必要，并能夠?yàn)楹罄m(xù)的魚(yú)露加工研究工作奠定理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡水魚(yú)下腳料：來(lái)源于江西鄱陽(yáng)湖水產(chǎn)食品有限公司，平板凍結(jié)后運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，-18℃冷凍保存，使用前在10℃以下進(jìn)行流水解凍。

甲醛、氫氧化鈉、硫酸、鹽酸、乙醚、硼酸均為分析純：南康市華億化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2高速組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；TDL-5A離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；DELTA-320精密pH計(jì)：美國(guó)梅特勒-托利多公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、85-1磁力攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；UT-12電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SX2-4-10箱式電爐：上海嘉益電爐有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淡水魚(yú)下腳料成分分析

下腳料中水分的測(cè)定：GB5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；灰分的測(cè)定：GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》；脂肪含量的測(cè)定：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》。

1.3.2 淡水魚(yú)下腳料自溶水解的工藝流程

淡水魚(yú)下腳料→解凍→打漿→加水→調(diào)pH→恒溫自溶水解→高溫滅酶活→離心沉降→測(cè)量指標(biāo)

1.3.3 淡水魚(yú)下腳料處理方法

淡水魚(yú)下腳料在10℃以下進(jìn)行流水解凍后，用搗碎機(jī)打漿，稱質(zhì)量，按設(shè)定的水解條件（加水量、調(diào)節(jié)pH、水解溫度、水解時(shí)間）在恒溫水浴鍋中進(jìn)行水解試驗(yàn)，水解過(guò)程中每天早晚各攪拌一次，水解完成后，90℃、20min滅酶活，離心沉降，測(cè)定水解澄清液中氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AA-N）含量。

1.3.4 自溶水解工藝條件單因素試驗(yàn)

溫度對(duì)自溶水解的影響：精確稱取每份100.0g打漿好了的鮮魚(yú)下腳料6份，用氫氧化鈉（或鹽酸）調(diào)配溶液pH值為6.0，水/魚(yú)下腳料比例為0.25∶1，用保鮮膜封好杯口，分別放在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃的恒溫水浴箱恒溫保存48h，測(cè)定水解澄清液的AA-N含量，確定較適自溶水解的溫度。

pH對(duì)自溶水解的影響：精確稱取每份100.0g打漿好了的鮮魚(yú)下腳料7份，按照水/魚(yú)下腳料0.25∶1的比例添加蒸餾水，用氫氧化鈉（或鹽酸）調(diào)配溶液pH值分別為4、5、6、7、8、9、10，用保鮮膜封好杯口，放在40℃的恒溫水浴箱恒溫保存48h，測(cè)定水解澄清液的AA-N含量，確定較適自溶水解的pH值。

加水比對(duì)自溶水解的影響：精確稱取每份100.0g打漿好了的鮮魚(yú)下腳料5份，用氫氧化鈉（或鹽酸）調(diào)配溶液pH值為5.0，按水/魚(yú)下腳料的比例分別為0∶1、0.25∶1、0.50∶1、0.75∶1、1.00∶1添加蒸餾水，用保鮮膜封好杯口，放在40℃的恒溫水浴箱恒溫保存48h，測(cè)定水解澄清液的AA-N含量，確定較適自溶水解的加水比。

時(shí)間對(duì)自溶水解的影響：精確稱取每份100.0g打漿好了的淡水魚(yú)下腳料3份，按照水/魚(yú)下腳料0.25∶1的比例添加蒸餾水，氫氧化鈉（或鹽酸）調(diào)整pH值為5.0，用保鮮膜封好杯口，放在40℃的恒溫水浴箱恒溫保存，分別于12h、24h、36h、48h、60h、72h，測(cè)定水解澄清液的AA-N含量，確定較適自溶水解的時(shí)間。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)確定的最佳試驗(yàn)因素水平的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，選擇時(shí)間（A）、pH（B）、溫度（C）為考察對(duì)象，以氨基酸態(tài)氮含量（Y）為考察指標(biāo)，采用Design Expert v 7.1.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)的因素水平如表1所示。

表1 淡水魚(yú)加工下腳料自溶水解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and coded levels of response surface analysis for freshwater fish processing leftovers autolysis technology optimization

1.3.6 游離氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定[13]

氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定采用甲醛滴定法，計(jì)算公式如下：

式中：AA-N為樣品中氨基酸態(tài)氮的含量（以氮計(jì)），g/100mL；V2為滴定樣品稀釋液消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V1為空白試驗(yàn)消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；0.014為氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；m為測(cè)定試樣溶液相當(dāng)于試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 淡水魚(yú)加工下腳料基礎(chǔ)成分

淡水魚(yú)下腳料基本成分如表2所示。

表2 淡水魚(yú)加工下腳料的基本成分Table 2 Elementary component of freshwater fish processing leftovers

由表2可知，淡水魚(yú)下腳料蛋白質(zhì)含量8.65%（以干質(zhì)量計(jì)為36.90%），含量較高，是較好的蛋白質(zhì)資源，可以作為蛋白質(zhì)資源進(jìn)一步加工利用。

2.2 淡水魚(yú)下腳料自溶水解單因素試驗(yàn)

2.2.1 溫度對(duì)淡水魚(yú)加工下腳料自溶水解的影響

溫度對(duì)淡水魚(yú)加工下腳料自溶水解的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同溫度下氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.1 Change of nitrogen content with different temperature

由圖1可知，在水/魚(yú)下腳料0.25∶1、初始pH值為6.0，35℃、40℃、45℃、50℃、55℃條件下水解48h，氨基酸態(tài)氮含量隨溫度的不同發(fā)生明顯變化。方差分析結(jié)果顯示，不同溫度之間（35～55℃）對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響均顯著（P＜0.05）。從35～40℃的過(guò)程中，自溶水解氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，40℃達(dá)（0.784±0.004）g/100mL，從40～55℃的過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量逐漸降低，且50℃以后氨基酸態(tài)氮含量降低的速度很快，原因是內(nèi)源性蛋白酶因溫度增高活性降低，溫度＜35℃，腐敗微生物的快速繁殖會(huì)導(dǎo)致魚(yú)露有腐敗的危險(xiǎn)[14]，通過(guò)感官及微生物檢測(cè)，40℃自溶水解48h沒(méi)有發(fā)生腐敗。從圖1可以看出，40℃是內(nèi)源性蛋白酶較適宜的水解溫度。

2.2.2 初始pH值對(duì)淡水魚(yú)加工下腳料自溶水解的影響

初始pH值對(duì)淡水魚(yú)加工下腳料自溶水解的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同初始pH值下氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.2 Change of amino nitrogen content with different initial pH

由圖2可知，在溫度為40℃、水/魚(yú)下腳料0.25∶1的條件下自溶水解48h，水解液的氨基酸態(tài)氮含量隨初始pH的不同而發(fā)生明顯的變化。方差分析顯示，pH在4.0～7.0對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響均顯著（P＜0.05），且pH值為5.0的顯著性最大，pH4.0和pH8.0對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在初始pH值為4.0～5.0，水解離心澄清液的氨基酸態(tài)氮的含量逐漸增加，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)（1.038±0.004 6）g/100mL；在初始pH值為5.0～10.0，水解液的氨基酸態(tài)氮含量逐漸降低，可能是因?yàn)閮?nèi)源性蛋白酶雖是混合酶，每種酶的含量不一樣，在一定的條件下也會(huì)表現(xiàn)出最適宜的酶解pH[15]，過(guò)高或過(guò)低的pH都會(huì)抑制其催化活性。由圖2可知，初始pH值為5.0得到的氨基酸態(tài)氮含量最高。

2.2.3 加水比對(duì)淡水魚(yú)下腳料自溶水解的影響

加水比對(duì)淡水魚(yú)下腳料自溶水解的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在初始pH值為5.0、溫度為40℃下自溶水解48h，水解液的氨基酸態(tài)氮隨水/魚(yú)下腳料的不同比例而發(fā)生明顯變化。方差分析顯示，不同加水比對(duì)氨態(tài)氮含量影響顯著（P＜0.05）。水/魚(yú)下腳料比例為0∶1時(shí)離心澄清液中的氨基態(tài)氮含量最高，達(dá)（0.987±0.0046）g/100mL，隨著加水量的增加氨基酸態(tài)氮的含量逐漸降低，當(dāng)水/魚(yú)下腳料為1∶1時(shí)，氨基酸態(tài)氮的含量為僅為（0.680±0.0017）g/100mL。原因是加水比小，相應(yīng)的內(nèi)源性蛋白酶濃度增加，在相同的條件下產(chǎn)生的氨基酸增加。但是結(jié)合實(shí)際，自溶水解過(guò)程中不加水，得出的魚(yú)露濃度過(guò)大，試驗(yàn)操作不易進(jìn)行且不經(jīng)濟(jì)，因此，選取水/魚(yú)下腳料為0.25∶1較為適宜。

圖3 不同加水比下氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.3 Change of amino nitrogen content with different water addition ratio

2.2.4 水解時(shí)間對(duì)淡水魚(yú)加工下腳料自溶水解的影響

水解時(shí)間對(duì)淡水魚(yú)加工下腳料自溶水解的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 氨基酸態(tài)氮含量隨水解時(shí)間的變化Fig.4 Change of amino nitrogen content with autolysis time

由圖4可知，在溫度為40℃、初始pH5.0、水/魚(yú)下腳料為0.25∶1的條件下自溶水解24h、36h、48h、60h，水解液中氨基酸含量隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。方差分析顯示，水解時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響均顯著（P＜0.05），且36h顯著性最大。在12～36h時(shí)間段氨基酸態(tài)氮含量增加較快，氨基酸態(tài)氮含量從（0.335±0.007）g/100mL上升至（0.789±0.012）g/100mL，48～72h氨基酸態(tài)氮含量增加緩慢，到48h達(dá)（0.847±0.023）g/100mL，隨后曲線逐漸趨于平緩。主要原因是隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)源性蛋白酶的催化活性逐漸降低[4]，從提取效率及動(dòng)力能源等因素考慮，選擇48h為自溶水解的最適水解時(shí)間。

2.3 淡水魚(yú)下腳料自溶水解的響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)淡水魚(yú)下腳料自溶水解影響較大的3個(gè)因素：時(shí)間（A）、初始pH值（B）、溫度（C）為考察對(duì)象，以氨基酸態(tài)氮含量（Y）為考察指標(biāo)，采用Design Expert v7.1.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)[16]。試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，回歸方程方差分析見(jiàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 淡水魚(yú)下腳料自溶水解工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface analysis for freshwater fish processing leftovers autolysis technology optimization

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 4 Variance analysis of quadratic regression model

由表4可知，時(shí)間（A）、pH（B）、溫度（C）3個(gè)各因素對(duì)水解液中氨基酸態(tài)氮的含量影響均極顯著，影響由小到大順序是A＞B＞C。

圖5 各因素兩兩交互作用對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plot and contour line of interaction among each two factors on amino acid nitrogen content

各因素兩兩交互作用的響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，初始pH值和時(shí)間對(duì)水解液中氨基酸態(tài)氮含量的影響存在交互作用；水解時(shí)間和水解溫度對(duì)水解液中氨基酸態(tài)氮含量的影響存在交互作用；初始pH值和水解溫度對(duì)水解液中氨基酸態(tài)氮含量的影響存在交互作用。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert.V8.0.6 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下：

由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（P＜0.000 1）說(shuō)明該模型與試驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可用于該反應(yīng)的理論推測(cè)。

2.4 自溶水解模型的驗(yàn)證試驗(yàn)

采用響應(yīng)面分析，得到淡水魚(yú)加工下腳料自溶水解最佳工藝條件為水解時(shí)間48h，水解溫度45℃，水解初始pH值5.0，預(yù)測(cè)自溶水解氨基酸態(tài)氮含量為1.062 2g/100mL。由于得到的最佳組合條件不在響應(yīng)面試驗(yàn)組合內(nèi)，所以需在最佳組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在此條件下進(jìn)行自溶水解試驗(yàn)，氨基酸態(tài)氮含量為（1.046 3±0.03）g/100mL，與預(yù)測(cè)值相差1.50%，說(shuō)明響應(yīng)面的試驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測(cè)值基本吻合，建立的模型可以對(duì)實(shí)際工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

以氨基酸態(tài)氮含量為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定淡水魚(yú)加工下腳料自溶水解的加水比、pH、溫度、時(shí)間的最適范圍。采用Design Expert v7.1.6軟件，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)得到水解度與時(shí)間（A）、pH（B）、溫度（C）關(guān)系的回歸模型，回歸方程為：Y=0.72+0.18A－0.043B+0.030C－0.008 5AB－0.013AC－0.025BC－0.057A2+0.078B2+0.003 6C2。淡水魚(yú)加工下腳料自溶水解最適宜工藝條件為水解時(shí)間48h，水解溫度45℃，水解初始pH值為5.0。水解時(shí)間、溫度、初始pH值3因素對(duì)響應(yīng)值的影響均顯著?；貧w模型的試驗(yàn)驗(yàn)證表明淡水魚(yú)加工下腳料自溶水解液中氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到了（1.046 3±0.03）g/100mL，與模型的預(yù)測(cè)值1.062 2g/100mL基本吻合，證明模型方程能很好的預(yù)測(cè)淡水魚(yú)加工下腳料內(nèi)源性蛋白酶自溶水解程度與溫度、時(shí)間、初始pH值之間的關(guān)系。利用淡水魚(yú)下腳料內(nèi)源性蛋白酶水解其蛋白質(zhì)，研究了響應(yīng)面優(yōu)化自溶水解的工藝，為后續(xù)利用淡水魚(yú)下腳料加工魚(yú)露的研究提供了一定的參考依據(jù)。

[1]LOPETCHARAT K,CHOI Y J,PARK J W,et al.Fish sauce products and manufacturing:a review[J].Food Rev Int,2001,17(1):65-88.

[2]PARK J N,FUKUMOTO Y,FUJITA E.Chemical composition of fish sauce produced in southeast and east Asia country[J].J Food Compos Anal,2001,14(2):113-125.

[3]徐 偉.魷魚(yú)加工廢棄物低鹽魚(yú)醬油速釀工藝及生化特性研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)博士論文，2008.

[4]呂英濤.鳀魚(yú)內(nèi)源性蛋白酶及低值魚(yú)制備魚(yú)醬油過(guò)程中的生化特性研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)碩士論文，2008.

[5]OSAKO K,HOSSAIN M A,KUWAHARA K,et al.Quality aspect of fish sauce prepared from underutilized fatty Japanese anchovy and rabbit fish[J].Fisheries Sci,2005,71(6):1347-1355.

[6]陳有容，張雪花，齊鳳蘭，等.白鰱廢棄物發(fā)酵魚(yú)露的成份分析及評(píng)價(jià)[J].中國(guó)水產(chǎn)，2002（4）：72-741.

[7]陳瑜珠，陶紅麗，曾慶孝，等.利用羅非魚(yú)加工下腳料發(fā)酵魚(yú)露的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（5）：441-443.

[8]薛 佳，曾名湧，董士遠(yuǎn)，等.羅非魚(yú)加工下腳料速釀低鹽優(yōu)質(zhì)魚(yú)露的研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2011，36（4）：41-47.

[9]苑艷輝，錢 和，姚衛(wèi)蓉.魚(yú)下腳料綜合利用之研究近況與發(fā)展趨勢(shì)[J].水產(chǎn)科學(xué)，2004，23（11）：40-42.

[10]候溫甫，黃澤元，汪秀文，等.淡水魚(yú)加工下腳料速釀低鹽魚(yú)露的工藝研究[J].食品科學(xué)，2009，30（23）：322-325.

[11]邵 偉，王 棟，陳 菽，等.淡水魚(yú)下腳料速釀魚(yú)露及脫腥技術(shù)初探[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27（11）：142-143.

[12]孔美蘭，吉宏武，章超樺.羅非魚(yú)下腳料自溶條件的初步探討[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25（4）：27-31.

[13]周光理.食品分析與檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

[14]翁武銀，陳書霖，劉光明，等.溫度對(duì)加曲速釀低鹽魚(yú)露性質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)科技，2012，33（23）：183-187.

[15]徐 偉，呂英濤，薛長(zhǎng)湖，等.魷魚(yú)加工副產(chǎn)物內(nèi)源性蛋白酶自溶水解工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2008，29（8）：176-179.

[16]任新見(jiàn)，時(shí)黨勇，汪劍輝.響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的正交方法研究[J].山西建筑，2005，31（2）：17-18.