崔霖蕓

（遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)部，貴州 遵義 563003）

自由基是含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱電子的原子、分子或離子。正常條件下，生物體內(nèi)僅1%～4%的O2產(chǎn)生超氧陰離子（O2－·）和羥自由基（·OH），但當(dāng)線粒體的結(jié)構(gòu)與功能受影響時(shí)，自由基產(chǎn)生增多[1]。自由基具有很強(qiáng)的氧化能力，若其數(shù)量超過機(jī)體的清除能力時(shí)便會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷，會(huì)直接或間接地降低酶活性，促使多糖降解、DNA 鏈斷裂，從而引起體內(nèi)代謝紊亂，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生[2]。因此，清除自由基對(duì)維持健康、延緩衰老、防癌抗癌等方面均有積極的作用。天然植物中含有豐富的抗氧化性物質(zhì)（如黃酮類化合物、多酚化合物、多糖化合物等）。研究顯示，物質(zhì)的還原力與其抗氧化性間有顯著的正相關(guān)性，還原力的高低可反映抗氧化能力的強(qiáng)弱[3]，黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)中具有數(shù)量不等的酚羥基因而具有較強(qiáng)的還原性，是很有潛力的抗氧化劑[4-5]。多酚類化合物是極好的氫或電子供體，且不會(huì)引發(fā)新的游離基或由于鏈反應(yīng)而被迅速氧化，具有很好的抗氧化效果[1]。多糖結(jié)構(gòu)中的醇羥基可以與產(chǎn)生·OH等自由基所必需的金屬離子絡(luò)合，使羥自由基的產(chǎn)生受到抑制[2，6]，從而具有一定的抗氧化性。此外，皂苷類、鞣質(zhì)類、褪黑素類、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)等均有一定的抗氧化作用[1]。

野木瓜（Stauntonia chinensis）是木通科（Lardizabalaceae）野木瓜屬植物。貴州省正安縣于1996 被國(guó)務(wù)院發(fā)展研究中心等單位命名為“中國(guó)野木瓜之鄉(xiāng)”，其盛產(chǎn)的野木瓜以果大、皮薄、肉細(xì)、氣香、味甘酸等特點(diǎn)著稱[7]。中醫(yī)典籍記載其莖葉微苦，其果味甘、平，歸心、腎經(jīng)[8]，具有舒筋活絡(luò)、解渴生津、平肝和胃、祛風(fēng)止痛等功效。現(xiàn)代研究表明，野木瓜中含有豐富的皂苷和木脂素苷類化合物，還含有黃酮苷類化合物、酚性成分、多糖類化合物[9]。此外，野木瓜果實(shí)中含有豐富的有機(jī)酸、果膠、胡蘿卜素、黃酮類、氨基酸、多種維生素和多種礦物質(zhì)等[10]，這些物質(zhì)很多是天然的抗氧化劑。國(guó)內(nèi)外對(duì)野木瓜的鎮(zhèn)痛抗炎、放射增敏及肝保護(hù)等方面的研究較多[11-12]，但對(duì)野木瓜提取物的抗氧化能力的研究卻很少。顯然，在人們?nèi)找骊P(guān)注自身保健的今天，若能發(fā)現(xiàn)野木瓜的抗氧化功效，將對(duì)開發(fā)其在保健、防癌抗癌方面的新用途具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮野木瓜果：購(gòu)自貴州正安縣。

石油醚（化學(xué)純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、水揚(yáng)酸、H2O2、HCl（化學(xué)純）：天津天大化學(xué)試劑廠；VC（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鐵氫化鉀、三氯乙酸、FeCl3、鄰苯三酚（分析純）：西安三浦化學(xué)試劑有限公司；pH=6.6的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液（配制方法見文獻(xiàn)[13]）、pH=8.34的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液（配制方法見文獻(xiàn)[14]）。

1.2 儀器與設(shè)備

752N紫外可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；SHZ-DⅢ型予華牌循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；BSA223型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；TL80-2型離心機(jī)：姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司；DK-S26 型恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PHS-2F型精密酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將野木瓜鮮果洗凈→去籽囊切成2～5mm 薄片→50℃烘干→粉碎后過40 目篩→石油醚脫色回流至石油醚無色→抽濾，濾渣風(fēng)干。

（1）準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的野木瓜粉5g，置入250mL圓底燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)83%的乙醇151mL，在70℃回流浸提2h，抽濾，濾液在60℃減壓濃縮，最后定容至25mL，得野木瓜醇提物。

（2）準(zhǔn)確稱取處理后的野木瓜粉5g，置入250mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水151mL，在70℃回流浸提2h，抽濾，濾液在60℃減壓濃縮，最后定容至25mL，得野木瓜水提物。

表1 實(shí)驗(yàn)取樣方案Table 1 Experimental design of sampling

1.3.2 野木瓜提取液還原力的測(cè)定[2，15-16]

試驗(yàn)采用Oyaizu法，主要根據(jù)待取液能將Fe3+還原為Fe2+的多少來檢測(cè)其還原能力。取表1中的各組待試液，分別加入pH=6.6的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液5.0mL，加入1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鐵氫化鉀3.0mL，50℃水浴恒溫反應(yīng)20min后急速冷卻，加入10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸3.0mL搖勻，于3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，依次加入蒸餾水2.0mL，0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）FeCl30.5mL，搖勻，靜置10min，在波長(zhǎng)700nm處測(cè)吸光度值，吸光度值越大則還原力越強(qiáng)。

1.3.3 野木瓜提取液對(duì)羥基自由基（·OH）的清除率的測(cè)定[16-18]

采用Fenton法，其基本原理：在過渡金屬離子催化作用下，過氧化氫可發(fā)生均裂產(chǎn)生羥自由基（·OH），反應(yīng)式為：

水楊酸捕獲·OH產(chǎn)生有色物質(zhì)，通過測(cè)定吸光度值，可以得出·OH的多少，若加入具有清除·OH功能的待測(cè)液，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，從而使反應(yīng)生成的有色物質(zhì)減少，由此可測(cè)定待測(cè)液對(duì)·OH的清除能力。

參照上述文獻(xiàn)方法，在19支25mL容量瓶中分別加入3.0mL 2mmol/L的FeSO4和3.0mL 6mmol/L的水楊酸，搖勻，加入表1中的各組待測(cè)液，最后向各容量瓶中分別加入3.0mL 2mmol/L的H2O2，搖勻后置入37℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)15min，取出在波長(zhǎng)510nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)，得到各待測(cè)液對(duì)·OH的清除率：

式中：A0為未加待測(cè)液（即加入4mL 蒸餾水）的吸光度值；Ax為加入各待測(cè)液后的吸光度值。

1.3.4 野木瓜提取液對(duì)超氧陰離子（O2－·）清除率的測(cè)定[16，19-20]

參考上述文獻(xiàn)的鄰苯三酚自氧化法，取pH=8.34的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液4.7mL，加入4.0mL蒸餾水搖勻，加入3mmol/L的鄰苯三酚0.3mL（以10mmol/L的HCl配制，空白管用10mmol/L的HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液），迅速搖勻倒入比色皿（1cm）中，在波長(zhǎng)325nm處測(cè)吸光度值，每隔30s記錄1次，至4.5min止，將所測(cè)吸光度值與時(shí)間回歸，其斜率即為鄰苯三酚自氧化速率。

樣品清除超氧陰離子自由基的測(cè)定：操作方法同上，在加入鄰苯三酚前，先將4.0mL蒸餾水換成表1中的各組待測(cè)液，按上述方法測(cè)吸光度值，回歸求得加入待測(cè)液后的鄰苯三酚自氧化速率。

式中：V0為未加待測(cè)液（即加入蒸餾水）時(shí)鄰苯三酚自氧化速率；Vx為加入待測(cè)液后的鄰苯三酚自氧化速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 野木瓜提取液還原力的測(cè)定

由圖1可見，隨著野木瓜提取液（或VC濃度）的增加，吸光度值剛開始迅速增加，當(dāng)提取液的量增加至1.5mL（或VC濃度增加至0.3mg/mL）后，增長(zhǎng)趨于平緩。吸光度值的大小反應(yīng)了還原力的強(qiáng)弱，由圖1可知，還原力由強(qiáng)到弱依次為VC＞野木瓜醇提物＞野木瓜水提物。當(dāng)加入野木瓜醇提物4mL時(shí)（相當(dāng)于從0.8g野木瓜粉中提取的液量，換算過程為5g÷25mL×4mL=0.8g，參見1.3.1），其還原力只是略低于0.8mg/mL的VC的還原力，說明野木瓜提取物有較強(qiáng)的還原力。還原力與抗氧化性間顯著正相關(guān)，還原力的高低反映了抗氧化能力的強(qiáng)弱[21]。因此說明野木瓜提取液有較強(qiáng)的抗氧化能力。

圖1 野木瓜提取液的還原力Fig.1 Reducing power of S.chinensis extraction solution

2.2 野木瓜提取液對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用

圖2 野木瓜提取液對(duì)·OH的清除Fig.2 ·OH scavenging effects of the S.chinensis extraction solution

圖2是不同量的野木瓜提取液與不同濃度VC對(duì)·OH的清除作用的對(duì)比曲線。當(dāng)加入野木瓜提取液的量較少時(shí)（或VC濃度較低時(shí)），對(duì)·OH的清除作用均較小，不到20%，隨著添加提取液量（或VC濃度）的增加，清除率迅速上升，其中VC的清除率上升最快，并迅速超過野木瓜提取液的清除能力，野木瓜兩種提取介質(zhì)（乙醇和蒸餾水）的提取液對(duì)·OH的清除作用差別不明顯。當(dāng)加入提取液的量超過2mL（或加入VC的質(zhì)量濃度超過0.4mg/mL）后對(duì)·OH的清除作用增速趨于平緩。當(dāng)加入4mL野木瓜提取液（相當(dāng)于從0.8g野木瓜中提取的量），對(duì)·OH的清除率可達(dá)77.42%（水提物）和76.66%（醇提物），與0.246mg/mL VC的清除率79.26%幾乎相當(dāng)（即加入4mL的0.8mg/mL VC的清除率，總反應(yīng)液量為13mL（見1.3.3），因此，反應(yīng)液中VC的質(zhì)量濃度為0.246mg/mL，說明野木瓜提取液對(duì)·OH有很好的清除作用。

2.3 野木瓜提取液對(duì)超氧陰離子（O2－·）的清除作用

圖3 野木瓜提取液對(duì)清除Fig.3 scavenging effects of the S.chinensis extraction solution

圖3給出了不同量的野木瓜提取液與不同濃度VC對(duì)超氧陰離子（O－2·）的清除作用對(duì)比，野木瓜乙醇提取液對(duì)O－2·的清除作用明顯高于其水提取液，這可能是乙醇提取液中溶出了更多黃酮類化合物的原故。野木瓜醇提物對(duì)O－2·的清除作用與VC的作用幾乎相當(dāng)，變化也相似。在加入醇提物的量較少（或VC濃度較低時(shí)），對(duì)O－2·的清除作用也較小，不到35%，但隨著量的增加，清除作用迅速增加，在超過2mL后（此時(shí)清除率達(dá)到87.42%）增速趨于緩和。當(dāng)加入4mL提取液量（相當(dāng)于從0.8g野木瓜粉中提取的液量），對(duì)O2－·的清除率可達(dá)到96.36%（乙醇提取），與0.356mg/mL的VC的清除率96.69%相當(dāng)（此處即為加入4mL 0.8mg/mL的VC時(shí)的清除率，總反應(yīng)液量為9mL（見1.3.4），因此，反應(yīng)液中VC的質(zhì)量濃度為0.356mg/mL），說明野木瓜乙醇提取液對(duì)O－2·有很好的清除作用。野木瓜水提取物對(duì)O－2·的清除作用稍小，但當(dāng)加入液量為4mL時(shí)，也達(dá)到90.78%，說明野木瓜水提物對(duì)O－2·也有較好的清除作用。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證實(shí)野木瓜乙醇提取液的還原力高于其水提取液的還原力，但均略低于VC的還原力，但在清除羥基自由基（·OH）能力上，醇提物與水提物及一定濃度的VC大致相等，野木瓜乙醇提取物對(duì)超氧陰離子（O－2·）的清除力與VC相當(dāng)，超過了96%，高于水提物的清除力。本實(shí)驗(yàn)的不足在于，由于實(shí)驗(yàn)條件及時(shí)間的局限，沒有對(duì)野木瓜提取液的成分進(jìn)行定量分析，但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道可推測(cè)野木瓜的抗氧化性主要可能來源于野木瓜中的黃酮類化合物、多酚類化合物、多糖類化合物[1-6]。醇提物在總還原力和對(duì)超氧陰離子的清除力上均高于水提物，可能是由于醇提物中溶解了更多的黃酮和多酚類化合物（根據(jù)極性相似相溶原理），而水提物中溶解了更多的多糖類化合物，提高了水提物對(duì)羥自由基的清除作用（多糖類化合物對(duì)羥自由基有較好的清除作用[2，6]）。本研究從總體上證明了野木瓜有很好的抗氧化作用，是一種較好的天然抗氧化劑，因此，對(duì)推廣和開發(fā)野木瓜飲品、食品、保健藥品等具有一定的指導(dǎo)作用。

[1]劉樹興，趙 芳.從天然植物中開發(fā)抗氧化劑研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（7）：179-182.

[2]張春梅，宋 海，魏生龍.荷葉離褶傘菌絲體多糖的提取及還原力的研究[J].中國(guó)食用菌，2012，31（6）：44-48.

[3]邢 懿，梁 波，汪 璐，等.黃山杜鵑總黃酮的體外抗氧化活性研究[J].華西藥學(xué)雜志，2013，28（1）：53-55.

[4]張 琳，陸維敏.黃酮類化合物抗氧化性能與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2006，33（2）：187-191.

[5]潘國(guó)慶，梁永欣.黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與抗氧化活性關(guān)系研究[J].青?？萍迹?005（3）：28-30.

[6]趙云濤，國(guó)興明，李付振.金櫻子多糖的抗氧化作用[J].生物學(xué)雜志，2003，20（2）：23-24.

[7]王文平，郭祀遠(yuǎn)，李 琳，等.野木瓜多糖中糖醛酸含量測(cè)定[J].食品科技，2007（10）：84-86.

[8]苗明三.法定中藥藥理與臨床[M].北京：世界圖書出版公司，1998.

[9]陳 瑛，李 錦，吳英良.野木瓜化學(xué)成分及其藥理和臨床研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25（11）：924-928.

[10]張 毅，王少敏.木瓜高效栽培與利用[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[11]陳國(guó)棟，楊 磊，陳少丹，等.野木瓜屬植物化學(xué)成分和生物活性研究概況[J].中藥材，2008（2）：309-315.

[12]陳 瑛，李 錦，吳英良.野木瓜化學(xué)成分及其藥理和臨床研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008（11）：924-928.

[13]龐戰(zhàn)軍.自由基醫(yī)學(xué)研究方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000.

[14]袁道強(qiáng)，黃建華.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2006.

[15]汪海波，劉大川，佘珠花，等.大豆異黃酮類物質(zhì)的提取、抗氧化性及穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué)，2004，25（1）：111-115.

[16]莫開菊，柳 圣，程 超.生姜黃酮的抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2006，27（9）：110-115.

[17]庫(kù)爾班·吐松，展 銳，張 宏，等.頂羽菊抗氧化活性研究[J].生物技術(shù)通訊，2010，21（3）：406-412.

[18]丁利君，周圳輝，林燕如.芒萁中黃酮物質(zhì)的提取及其抗氧化研究[J].食品科學(xué)，2005，26（8）：77-81.

[19]鄒國(guó)林，桂興芬，鐘曉凌，等.一種SOD 的測(cè)活方法——鄰苯三酚自氧化法的改進(jìn)[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1986（4）：71-73.

[20]曾小玲.七種菊科植物抗活性氧作用的研究對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，1999，9（2）：44-52.

[21]邢 懿，梁 波，汪 璐.黃山杜鵑總黃酮的體外抗氧化活性研究[J].華西藥學(xué)雜志，2013，28（1）：53-55.