姜 莉，周寶龍，楊 燁，葉群梁，劉學(xué)波，王玉堂

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西朱鹮黑米酒業(yè)有限公司 陜西 洋縣 723300)

黑米酒以黑米為主要原料，通過(guò)傳統(tǒng)的發(fā)酵和勾兌工藝制成，由于其具有獨(dú)特的香氣和風(fēng)味以及較低的酒精度，受到越來(lái)越多消費(fèi)的青睞[1-2]。黑米中含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)，組成齊全的氨基酸以及多種微量元素（Se、Zn、Fe、Mn、Ge等）和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[3]。此外黑米中還含有能調(diào)節(jié)人體多種生理功能的酚類成分（如花色苷、黃酮以及酚酸類物質(zhì)等），這些成分具有抗氧化、延緩衰老、降血壓、防齲齒、防輻射、抗過(guò)敏、抗癌、抗血小板凝聚、消炎等功能特性[4-5]。黑米作為一種天然保健食品，同時(shí)也是功能食品的理想原料[6-7]。近年來(lái)，不少地方出現(xiàn)以黑米、紅米等為主要原料的釀酒企業(yè)，這對(duì)黑米的開發(fā)和深加工有著積極深遠(yuǎn)的意義。目前，關(guān)于黑米酒中酚類活性物質(zhì)的種類和含量的研究未見報(bào)道，建立準(zhǔn)確的定量方法對(duì)研究黑米酒的保健功能以及質(zhì)量控制具有重要意義。酚酸類化合物分析的方法有紙色譜、薄層色譜、氣相色譜、高效液相色譜[8-11]、毛細(xì)管電泳和膠束毛細(xì)管電動(dòng)色譜等。由于高效液相色譜具有多種組分同時(shí)測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，廣泛用于食品中黃酮、酚酸類物質(zhì)的檢測(cè)。如李永庫(kù)等[12]對(duì)葡萄酒、方玲玲等[13]對(duì)櫻桃酒、劉群濤等[14]對(duì)啤酒、胡華等[15]對(duì)醬油、孫崇臻等[16]對(duì)蜂蜜中的多種酚酸及黃酮類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，建立了可靠的分析方法。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法-二級(jí)管陣列檢測(cè)（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）法，建立了黑米酒中8種酚酸（沒食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸）和3種黃酮類物質(zhì)（蘆丁、異槲皮苷和槲皮素）同時(shí)測(cè)定的方法，并用于同類米酒的測(cè)定。該方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為研究米酒的功能成分及其質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米酒：陜西朱鹮黑米酒業(yè)有限公司；紅米酒：井岡山市絹花紅米酒廠；黃酒：紹興白塔釀酒有限公司。

沒食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素標(biāo)品購(gòu)于上海純優(yōu)生物科技有限公司。色譜級(jí)甲醇、乙腈、冰乙酸和乙酸乙酯購(gòu)于美國(guó)天地公司。水為蒸餾水和超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（配SPD-M20A檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器及CLASS-VP工作站）：日本島津公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；生化儀器KQ-600DB數(shù)控超聲波清洗器：江蘇昆山超聲儀器公司；PHS-3C酸度計(jì)：上海雷磁精科儀器廠；萬(wàn)分之一天平：梅特勒-托利公司。

1.3 色譜條件

色譜柱C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A為100%超純水水（含1%乙酸），B 為50%乙腈溶液（含1%乙酸）。低壓梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速1mL/min。沒食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，咖啡酸、香豆酸和阿魏酸檢測(cè)波長(zhǎng)320nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為20μL。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理[17-18]

取一定樣品，用濃鹽酸調(diào)至pH=2.0，然后準(zhǔn)確吸取樣品10mL于125mL分液漏斗中，加入20mL 水，再加入30mL乙酸乙酯，振搖1min，靜置10min，待分層完全后將下層液再次進(jìn)行萃取，合并乙酸乙酯層。40℃條件下減壓濃縮至干。殘?jiān)?mL20%乙腈溶解，0.45μm濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，用甲醇溶解定容至10mL，得到每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的貯備溶液500mg/L，置于4℃冰箱中避光保存。分別移取1mL 各單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液混合，用20%乙腈溶液定容至50mL 得到質(zhì)量濃度為10mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將11種500mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋后進(jìn)行進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描，各待測(cè)的最大吸收波長(zhǎng)見表2。實(shí)驗(yàn)確定，定量測(cè)定沒食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，咖啡酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇[19]

以C18色譜柱為固定相時(shí)，常用的流動(dòng)相有甲醇-水、乙腈-水等[20]。但是由于酚羥基、羧基在水溶液中發(fā)生電離，極性增強(qiáng)，在固定相表面形成雙重保留，易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。加入少量酸性試劑，可抑制酚類物質(zhì)的電離，以中性分子的形態(tài)存在，極性減弱，有利于增強(qiáng)在固定相上的保留，提高分離度，避免色譜峰拖尾。分別對(duì)水-甲醇體系，水-乙腈體系作為流動(dòng)相進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)最終選擇水為A相，50%乙腈為B相，二者均含有1%乙酸，在此條件下，梯度洗脫時(shí)，基線發(fā)生較小的飄移，并獲得較好的分離效果。

2.1.3 梯度洗脫條件

由于酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似，要實(shí)現(xiàn)11種酚類物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)，需采用梯度洗脫的方式改善分離度。實(shí)驗(yàn)對(duì)洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化，確定洗脫程序。洗脫程序見表1。在此梯度洗脫條件下，11種酚類物質(zhì)達(dá)到很好的色譜分離，標(biāo)樣色譜圖見圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Elution program of mobile phase

圖1 11種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(260nm、320 nm)Fig.1 Chromatograms of 11 phenolic acid standards at 260nm and 320nm

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別取儲(chǔ)備液適量，用甲醇配制0.5mg/L、1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在確定的色譜條件下進(jìn)樣分析，平行測(cè)定3次，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，11種酚類物質(zhì)在質(zhì)量濃度為0.5～10.0mg/L范圍內(nèi)的線性良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.996，結(jié)果見表2。

表2 11種酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線與相關(guān)系數(shù)Table 2 Standard curves and correlation coefficients of eleven phenolic substances

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

為考察方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行重復(fù)6次測(cè)定，以各組分色譜峰峰面積的計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3，RSD為1.3%～3.3%，由此可見，該方法穩(wěn)定性和精密度較好。

2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

表3 方法的精密度和黑米酒加標(biāo)回收率(n=6)Table 3 Precision and recovery of standard addition of black rice wine

為考察方法的準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確吸取黑米酒10mL，加入2mL 10mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液，混勻后按照樣品處理的方法進(jìn)行處理，在上述色譜條件下測(cè)定，重復(fù)3次，測(cè)得回收率結(jié)果見表3。11種酚類物質(zhì)加標(biāo)回收率為83.5%～105.1%。

2.5 樣品測(cè)定

根據(jù)前述的樣品提取條件和色譜條件，對(duì)黑米酒中的酚類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。黑米酒提取液色譜圖見圖2。實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)其他米酒產(chǎn)品的多酚類物質(zhì)進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果見表4。由此可見，不同米酒中的酚類物質(zhì)含量差別較大，黑米酒中11種組分均有檢出，其中原兒茶酸含量最高，為7.612mg/L，咖啡酸含量較高，異槲皮苷、蘆丁也明顯高于其他2種米酒。紅米酒、糯米酒中對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸相對(duì)含量較高。

圖2 黑米酒中酚酸色譜圖(260nm、320nm)Fig.2 Chromatograms of black rice wine at 260nm and 320nm

表4 幾種米酒中黃酮和酚酸類物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果Table 4 Contents of flavonoids and phenolic acids in rice wine

3 討論與結(jié)論

3.1 建立了可用于黑米酒中酚類化合物分析的高效液相色譜方法。采用50%乙腈-超純水（含1%乙酸）為流動(dòng)相，低壓梯度洗脫，11種酚類物質(zhì)在45min內(nèi)得到了較好分離?；厥章试?3.5%～105.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～3.3%。表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于米酒中酚類物質(zhì)測(cè)定。

3.2 通過(guò)對(duì)采用不同原料釀造米酒中的酚類物質(zhì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，米酒中酚類物質(zhì)的含量和種類與原料來(lái)源密切相關(guān)，這為米酒類產(chǎn)品的開發(fā)及其保健功能的研究提供依據(jù)。

3.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)種類有限，尚有多種酚類物質(zhì)未能確定，將進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)譜進(jìn)行判斷。

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