嘎拉沁·滿都拉, 上井幸司，湯口實(shí)，巖佐達(dá)郎*

(1. 內(nèi)蒙古師范大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特0100022；2. 室蘭工業(yè)大學(xué)，日本 北海道室蘭050-8585)

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HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定生藥梔子主要成分

嘎拉沁·滿都拉1,2, 上井幸司2，湯口實(shí)2，巖佐達(dá)郎2*

(1. 內(nèi)蒙古師范大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特0100022；2. 室蘭工業(yè)大學(xué)，日本 北海道室蘭050-8585)

目的：建立梔子中主要活性成分京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷同時(shí)進(jìn)行定性定量分析方法。方法：采用HPLC-MS/MS質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，同時(shí)測(cè)定梔子水提取液中主要成分。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，正離子檢測(cè)，掃描范圍10～1000(m/z)；色譜測(cè)定使用ACE C8(100mm×2.1mm,5μm)色譜柱，以甲醇-水梯度洗脫，流速0.2mL· min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)240nm，柱溫30℃。結(jié)果：梔子中確定了京尼平苷、京尼平龍膽二糖苷和羥異梔子苷等3種成分；在定量分析中主要成分京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷均在0.1～100μg·mL-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r=1.000 00和r =0.999 98)。結(jié)論：HPLC-MS/MS法對(duì)梔子中主要成分可準(zhǔn)確、快速、同時(shí)進(jìn)行定性定量分析，對(duì)生藥梔子的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

梔子；HPLC-MS/MS；京尼平苷；京尼平龍膽二糖苷

梔子(Gardenia jasminoides Ellis)是茜草科(Rubiaceae)植物梔子，其干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效[1]。其化學(xué)成分主要含環(huán)烯醚萜類成分，如京尼平苷(geniposide)、京尼平龍膽二糖苷(genipingentiobioside)、羥異梔子苷(gardenoside)、京尼平苷酸(geniposidic acid)等[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，梔子具有抗炎、抗氧化、利膽、利尿、抗腫瘤、解熱、鎮(zhèn)痛、輻射防護(hù)、降血脂等多種藥理活性，已成為目前研究的熱點(diǎn)[3]。

HPLC/MS/MS技術(shù)在中藥化學(xué)成分、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及指紋圖譜研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4,5]。目前，已有的研究是對(duì)梔子中梔子酸、京尼平苷(梔子苷)、西紅花苷、京尼平等進(jìn)行HPLC含量測(cè)定[6-9]，或者對(duì)梔子的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析[10-12]，而用色譜法與質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定梔子中京尼平苷、京尼平龍膽二糖苷和羥異梔子苷進(jìn)行定性和定量分析的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。筆者采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定梔子中化學(xué)活性成分，并對(duì)其色譜峰保留時(shí)間、一級(jí)和二級(jí)掃描質(zhì)譜圖與對(duì)照品比較，對(duì)京尼平苷、京尼平龍膽二糖苷進(jìn)行了定性定量分析。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀Prominence LC-20A (日本SHIMADZU公司)，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀API2000 LC/MS/MS三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)AB SCIEX公司)，數(shù)控式超聲波細(xì)胞粉碎器，SONOPULS UW2070, BANDELIN，高速大容量冷卻離心機(jī)7780(日本KUBOTA)，Milli-Q超純水裝置(美國(guó)Millipore公司)，紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)UVmini-1240(日本島津)。

1.2 試劑

流動(dòng)相用甲醇為色譜純，日本(Wako)；蒸餾水為HPLC用蒸餾水；對(duì)照品京尼平苷，日本(Wako)，批號(hào)00007070-212；對(duì)照品京尼平龍膽二糖苷，四川省維克奇生物科技，批號(hào)130527；梔子(購(gòu)于內(nèi)蒙古藥店)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

對(duì)照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷分別配置1mg·mL-1的水溶液和1∶1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，使用前再稀釋100倍。

2.2 供試品溶液制備

生藥梔子研細(xì)，過(guò)60目篩，精密稱取粉末0.5g，加超純水10mL，超聲 (70W、20kHz) 提取30min，高速離心機(jī)離心(3 000rpm)20min，上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。HPLC測(cè)定時(shí)將供試品溶液再稀釋1 000倍后使用。

2.3 色譜、質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：ACE C8(100mm×2.1mm,5μm)色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-水溶液(梯度洗脫)；流速：0.2mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：0.5μL。

質(zhì)譜條件:電離源：電噴霧離子源 (ESI)；掃描模式：正離子檢測(cè)(positive)；掃描范圍：10～1100(m/z)；毛細(xì)管電壓(IS)：LC-MS為5 500 V; MS/MS為4 500 V; 霧化器壓強(qiáng)：LC-MS為50 psi; MS/MS為17 psi；干燥器溫度：300 ℃；碎片電壓：120 V。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用AB SCIEX公司Analyst 1.4.2軟件處理。

2.4 結(jié)果

2.4.1 定性分析(質(zhì)譜測(cè)定) 取供試品梔子水溶液，注入質(zhì)譜聯(lián)用儀API2000，進(jìn)行MS測(cè)定。測(cè)得質(zhì)譜圖中主要峰的質(zhì)量電荷比分別為410.9 m/z,amu、572.7 m/z,amu和426.9 m/z,amu，見(jiàn)圖1。

分別取對(duì)照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷溶液注入質(zhì)譜聯(lián)用儀API2000，進(jìn)行MS測(cè)定。測(cè)得對(duì)照品京尼平苷(分子量388.1)和京尼平龍膽二糖苷(分子量550.2)的質(zhì)量電荷比分別為410.8 m/z,amu(M+Na=388.1+22.7 )和572.9 m/z,amu(M+Na=550.2+22.7)，見(jiàn)圖2 A、B。對(duì)照品的準(zhǔn)離子峰進(jìn)行MS/MS測(cè)定，二級(jí)質(zhì)譜碎片離子中分別測(cè)得質(zhì)荷比(22.8±0.5)m/z,amu的離子(圖略)，推斷為Na離子。

圖1 梔子提取液質(zhì)譜總離子流

圖2 對(duì)照品質(zhì)譜

2.4.2 定量分析(液相色譜) 取供試品梔子水溶液，京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的混合對(duì)照品溶液各0.5μL注入高效液相色譜儀中，進(jìn)行HPLC-MS測(cè)定。供試品色譜圖中峰1、峰2和峰3的保留時(shí)間分別為15.23min、14.16min和11.71min(圖3A)，其中峰1和峰2與對(duì)照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的保留時(shí)間完全吻合(見(jiàn)圖3B)。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的溶液，用超純水配制分別為0.1、1、5、50、100 mg·mL-1等不同濃度的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行進(jìn)樣測(cè)定3次。以對(duì)照品濃度C(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以色譜峰峰面積Y為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的直線回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r)分別為：

Y=22863X-1045.2 r=1.000 00

Y=18471X-3431.9 r=0.999 98

圖3 對(duì)照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的混合溶液HPLC圖譜

京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷均在0.1～100mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，分析方法學(xué)效能指標(biāo)滿足定量分析方法驗(yàn)證要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫下放置，照“2.3”項(xiàng)下分別于制備后0、2、4、6、8、10、12h 進(jìn)樣0.5μL。結(jié)果京尼平苷的平均峰面積為68 500，RSD為 0.21%，京尼平龍膽二糖苷的平均峰面積為7 417，RSD為 1.22%。表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取供試品溶液，每次進(jìn)樣0.5μL，連續(xù)進(jìn)樣5次。測(cè)得京尼平苷平均峰面積的RSD為 0.18%，京尼平龍膽二糖苷平均峰面積的RSD為 0.70%。表明本辦法精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備梔子供試品溶液6份，分別進(jìn)樣0.5μL，測(cè)定色譜峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算含量，求得京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的平均含量(n=6)分別為4.84%，RSD為0.96%和1.20%，RSD為0.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加標(biāo)回收率

精密吸取供試品溶液，分別添加1.0ppm濃度的對(duì)照品混合溶液，進(jìn)樣0.5μL進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)添加水平測(cè)定5次，京尼平苷的平均加樣回收率和RSD分別為 109.13%和0.30%；京尼平龍膽二糖苷的平均加樣回收率和RSD分別為94.49%和0.31%。

2.10 含量測(cè)定

按“2.3”項(xiàng)下方法制備梔子的供試品溶液6份，分別精密吸取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液各0.5μL，注入HPLC

儀，測(cè)定色譜峰峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量，測(cè)得京尼平苷平均含量為4.842%，RSD為0.96%；京尼平龍膽二糖苷平均含量為1.1976%，RSD為0.47%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行水、甲醇和甲醇-水混合溶液(50∶50)等不同溶劑進(jìn)行提取，對(duì)比結(jié)果表明水提取液測(cè)得成分含量較高。分光光度計(jì)進(jìn)行200～650nm波長(zhǎng)掃描，對(duì)照品京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷的最大吸收峰分別為238nm和239nm，因此后續(xù)試驗(yàn)采用240nm檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行兩種成分同時(shí)檢測(cè)。液相色譜柱子分別使用C18和C8柱子，均能測(cè)得樣品的活性成分，但C8柱子更能提高效率，故選擇C8柱子。

生藥提取液是包含多個(gè)化學(xué)成分的極其復(fù)雜的混合物。色譜法很難同時(shí)檢測(cè)其所有化學(xué)成分。質(zhì)譜檢測(cè)器可以很好地解決這個(gè)問(wèn)題，它對(duì)生藥的多種成分均能夠檢測(cè)。本文采用HPLC-MS/MS質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)所建立的生藥梔子中京尼平苷和京尼平龍膽二糖苷含量測(cè)定方法高效、準(zhǔn)確、全面地評(píng)價(jià)其活性成分，在生藥研究及質(zhì)量控制方面是一個(gè)可行的方法。

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(責(zé)任編輯：王尚勇)

2014-01-26

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2011MS0204)；室蘭工業(yè)大學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目(國(guó)際合作)

嘎拉沁·滿都拉(1968-)，男，蒙古族，工學(xué)博士，內(nèi)蒙古師范大學(xué)講師，研究方向?yàn)槊伤?、天然藥化學(xué)成分。

巖佐達(dá)郎，日本室蘭工業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師。

R284.1

A

1673-2197(2014)08-0027-03