白麗娟，袁若

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

信號(hào)放大策略在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用進(jìn)展

白麗娟，袁若*

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

電化學(xué)適體傳感器通過(guò)測(cè)定適體與目標(biāo)物作用前后電化學(xué)信號(hào)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)快速、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。為進(jìn)一步提高傳感器的靈敏度，增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)成為研究者們?cè)跇?gòu)建電化學(xué)適體傳感器中常用的手段。通過(guò)納米材料、生物及化學(xué)等方法放大傳感器界面的響應(yīng)信號(hào)，能特異性地提高檢測(cè)信號(hào)，降低噪音信號(hào)，對(duì)于提高傳感器的靈敏度具有十分重要的意義。該文簡(jiǎn)要介紹了電化學(xué)適體傳感器的原理，重點(diǎn)評(píng)述了近十年來(lái)信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)適體傳感器方面的研究和應(yīng)用進(jìn)展。

信號(hào)放大；電分析；適體；生物傳感器；綜述

0 引言

美國(guó)的Szostak[1]和Gold[2]研究小組在1990年各自獨(dú)立地建立核酸文庫(kù)，并利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，簡(jiǎn)稱(chēng)作SELEX技術(shù)），從該核酸文庫(kù)中篩選與配體具有高效和特異結(jié)合的DNA或RNA片段。該篩選得到的片段被稱(chēng)為適體（aptamer），也稱(chēng)為核酸適體、適配體、適配子等，是一段長(zhǎng)度約25～80個(gè)堿基的單鏈寡核苷酸，能與蛋白質(zhì)、有機(jī)物、小分子、金屬離子、多肽等各種配體特異性結(jié)合[3]。目前，適體已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)理論研究、藥物的研發(fā)、疾病診斷和治療等方面。

將適體作為電化學(xué)適體傳感器的分子識(shí)別元件，與其它分子識(shí)別元件相比具有以下的優(yōu)點(diǎn)。（1）體外篩選、化學(xué)合成：適體通過(guò)SELEX技術(shù)體外篩選，篩選出的適體可通過(guò)化學(xué)方法生產(chǎn)合成，具有確定的組成和較高的純度，其制備過(guò)程更為簡(jiǎn)單和低成本。（2）可修飾性：適體的本質(zhì)是一段寡核苷酸片段，因此可以將其兩端進(jìn)行修飾，而對(duì)其生物活性并不產(chǎn)生影響。（3）目標(biāo)物作用范圍廣：適體不僅可以與抗體、酶、生成因子等大分子的蛋白質(zhì)目標(biāo)物結(jié)合，也可以與氨基酸、金屬離子、藥物、核苷酸等小分子目標(biāo)物結(jié)合，甚至能與完整的細(xì)胞、細(xì)菌、病毒等目標(biāo)物進(jìn)行結(jié)合[4～5]。（4）高特異性和親合力：適體和配體之間具有極高的親合力，通常比抗體和抗原間的親合力要強(qiáng)，因而可以極大地避免非特異性結(jié)合所產(chǎn)生的影響。（5）分子量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單：適體作為單鏈寡核苷酸片段，其堿基數(shù)一般為25～80，具有較小的分子量，便于修飾與固定。（6）穩(wěn)定性好，可反復(fù)使用和長(zhǎng)期保存：與抗體相比，適體具有良好的穩(wěn)定性，能在低溫冷凍的條件下保存數(shù)年，即使在高鹽濃度、高溫和絡(luò)合劑等的作用下發(fā)生變性后，也能在適當(dāng)?shù)臈l件下恢復(fù)其活性，因而可以反復(fù)利用，提高傳感器的使用壽命。

適體的出現(xiàn)，不僅彌補(bǔ)了現(xiàn)有抗體存在的不足，也為傳統(tǒng)的免疫傳感器的發(fā)展開(kāi)辟了一條新道路。將適體作為分子識(shí)別元件構(gòu)建電化學(xué)適體傳感器，具有操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)快速、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，受到了越來(lái)越多科學(xué)研究者的關(guān)注。該文擬簡(jiǎn)要介紹電化學(xué)適體傳感器的原理，重點(diǎn)評(píng)述近十年來(lái)的信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)適體傳感器方面的研究和應(yīng)用進(jìn)展。

1 電化學(xué)適體傳感器

電化學(xué)傳感器是應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)傳感器，具有成本低、響應(yīng)快速、選擇性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。電化學(xué)適體傳感器是將適體作為分子識(shí)別物質(zhì)與電化學(xué)傳感器相結(jié)合而構(gòu)建的檢測(cè)裝置，其集合了電化學(xué)傳感器和適體的優(yōu)勢(shì)，既具有電化學(xué)分析方法的高靈敏度、低檢測(cè)成本、響應(yīng)快速等顯著優(yōu)點(diǎn)，又具有適體的穩(wěn)定性好、選擇性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥物分析、疾病診斷等方面具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

圖1 電化學(xué)適體傳感器的原理示意圖Fig.1Schematic diagram of the principle for the electrochemical aptasensor

電化學(xué)適體傳感器可定義為一種將適體作為分子識(shí)別物質(zhì)結(jié)合到感受器表面，通過(guò)換能器將目標(biāo)分析物與適體作用產(chǎn)生的生物信號(hào)轉(zhuǎn)換成為可檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)的裝置（圖1）。適體與目標(biāo)分析物在感受器表面發(fā)生特異性識(shí)別反應(yīng)后，產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)的生物信號(hào)，再通過(guò)換能器（測(cè)量電極、熱敏電阻、場(chǎng)效應(yīng)晶體管等）將該信號(hào)轉(zhuǎn)換成與目標(biāo)分析物濃度等相關(guān)的可定量處理的電化學(xué)信號(hào)，因而可以利用目標(biāo)分析物與適體作用前后電化學(xué)信號(hào)的變化情況來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)。目前，用于適體固載的工作電極主要有金電極[6]、氧化銦錫電極[7]、玻碳電極[8]、金芯片電極[9]和金陣列電極[10]等。電化學(xué)定量檢測(cè)的方法主要有循環(huán)伏安法[11]、差分脈沖伏安法[12]、溶出伏安法[13]、線性掃描伏安法[14]、方波伏安法[15]和法拉第阻抗譜[16]等。

2 信號(hào)放大在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用

為進(jìn)一步提高傳感器的靈敏度，增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)成為研究者們?cè)跇?gòu)建電化學(xué)適體傳感器中常用的手段。增強(qiáng)傳感器檢測(cè)信號(hào)的方式通常有兩種，一種是通過(guò)納米材料、酶催化等生物放大技術(shù)特異性的放大傳感器界面上的檢測(cè)信號(hào)；另一種是通過(guò)靈敏度更高的檢測(cè)儀器實(shí)現(xiàn)輸出信號(hào)的二次放大。相比而言，前者是特異性的提高檢測(cè)信號(hào)，降低噪音信號(hào)；后者則是將檢測(cè)信號(hào)和噪音信號(hào)同比放大，因此，新型信號(hào)放大技術(shù)的研究以及多種信號(hào)放大技術(shù)的聯(lián)用對(duì)提高傳感器的靈敏度具有十分重要的意義。

2.1 納米材料放大技術(shù)

納米材料因其特殊的物理化學(xué)性質(zhì)（如量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等）而具有獨(dú)特的電化學(xué)及光學(xué)性質(zhì)，并作為傳感器界面的修飾材料和生物分子的固載基質(zhì)被廣泛應(yīng)用到生物傳感器的構(gòu)建中[17～21]。納米材料的小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)使其具有大的活性比表面積和高的表面自由能，在與其他分子結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出很高的化學(xué)活性，同時(shí)可提高生物分子的固載量。納米材料的宏觀量子隧道效應(yīng)起到了促進(jìn)電子傳遞的作用，將納米材料作為電極的固載基質(zhì)，能有效增加電極的比表面積，增強(qiáng)導(dǎo)電性，從而提高傳感器的響應(yīng)速度。此外，納米材料具有較好的生物相容性，能為生物分子提供良好的微環(huán)境，對(duì)保持生物分子的活性起到了積極的作用，提高傳感器的穩(wěn)定性。一些納米材料也被證實(shí)對(duì)于特定的底物有良好的催化活性，如金納米粒子[22]、鉑納米粒子[23]、鈀納米粒子[24]、石墨烯[25]等，將其作為傳感器的標(biāo)記物或固載基質(zhì)在提高傳感器的響應(yīng)性能方面具有十分重要的作用。

圖2 基于納米金放大的電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[26]Fig.2Schematic diagram of the principle for the electrochemical aptasensor with gold nanoparticles for amplification

Wang等[26]利用納米金的信號(hào)放大作用構(gòu)建了一種夾心型電化學(xué)適體傳感器用于血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF-BB）的高靈敏檢測(cè)（圖2）。首先將大量的PDGF-BB適體修飾到納米金表面得到功能化的納米金復(fù)合物，再通過(guò)夾心反應(yīng)將該納米金復(fù)合物引入到金電極表面形成捕獲適體-目標(biāo)分析物-納米金復(fù)合物的夾心結(jié)構(gòu)，利用納米金表面的適體帶負(fù)電，能通過(guò)靜電作用吸附大量的電活性的[Ru(NH3)5Cl]2+。隨著目標(biāo)分析物濃度的增大，電化學(xué)信號(hào)逐漸增加，對(duì)目標(biāo)物PDGF-BB的檢測(cè)限可達(dá)0.01 pmol/L。

碳納米管的特殊中空管狀結(jié)構(gòu)使之具有許多優(yōu)良的特性，例如比表面積大、耐熱、傳熱和導(dǎo)電性好、強(qiáng)度高和生物相容性好等，被廣泛用于電化學(xué)適體傳感器的構(gòu)建。石墨烯作為一種由碳原子sp2雜化組成的蜂巢狀的晶格平面薄層，是厚度只有一個(gè)碳原子的二維材料，具有更大的比表面積和良好的導(dǎo)電性。Zhang等[27]結(jié)合多種納米材料的信號(hào)放大作用構(gòu)建了一種夾心型的凝血酶適體傳感器。首先在玻碳電極表面利用石墨烯大的比表面積來(lái)固載凝血酶適體1，與凝血酶特異性結(jié)合后，再通過(guò)夾心反應(yīng)與適體2復(fù)合物結(jié)合，該復(fù)合物利用SiO2修飾的碳納米管作為放大，能有效提高電活性物質(zhì)硫堇的固載量，利用復(fù)合物表面納米鉑和卟啉鐵的協(xié)同催化作用，對(duì)于目標(biāo)物凝血酶的檢測(cè)限為50 fmol/L。此外，Xiang等[28]利用具有良好導(dǎo)電性和大比表面積的碳納米管用于固載大量的堿性磷酸酯酶（ALP）和標(biāo)記凝血酶適體，將該復(fù)合物通過(guò)夾心反應(yīng)引入到電極表面，通過(guò)ALP與檢測(cè)底液中的心肌黃酶在兩種底物的存在下多重催化放大檢測(cè)信號(hào)，使得該傳感器對(duì)凝血酶的檢測(cè)限達(dá)到了8.3 fmol/L。

歸納起來(lái)，納米材料主要通過(guò)三種方式來(lái)增強(qiáng)電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)：（1）利用納米材料大的活性比表面積來(lái)增加電活性物質(zhì)的固載量，從而放大電流響應(yīng)信號(hào)；（2）利用納米材料提高具有催化活性的納米粒子或酶的固載量，通過(guò)提高催化響應(yīng)電流來(lái)提高電化學(xué)信號(hào)；（3）利用其自身良好的催化活性及導(dǎo)電性促進(jìn)電子傳遞的速率，進(jìn)而增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。

2.2 生物放大技術(shù)

生物放大技術(shù)由于具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、生物兼容性和專(zhuān)屬特異性高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛地應(yīng)用于電化學(xué)分析中。一些生物放大技術(shù)，如酶催化放大、親和素-生物素放大、核酸體外擴(kuò)增放大（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）、目標(biāo)循環(huán)放大等，被廣泛應(yīng)用到電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建中。以下就幾種典型的生物放大技術(shù)在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用分別作簡(jiǎn)要介紹。

2.2.1 酶催化放大技術(shù)

酶催化放大技術(shù)是生物放大技術(shù)中運(yùn)用較成熟的技術(shù)之一。酶（enzyme）是由生物體產(chǎn)生的一類(lèi)具有調(diào)節(jié)生命活動(dòng)能力的蛋白質(zhì)，人體中的各種代謝和反應(yīng)都離不開(kāi)酶的參與，酶對(duì)于其相應(yīng)底物的催化具有高效和高度的專(zhuān)一性。酶通過(guò)催化底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的電子傳遞來(lái)增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)，因此，將酶的催化作用運(yùn)用到電化學(xué)傳感器的構(gòu)建中能有效的提高傳感器的靈敏度和實(shí)用性。常用的酶有堿性磷酸酯酶（ALP）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。酶在電極表面的固定通常是利用共價(jià)鍵合和納米技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因此酶催化放大技術(shù)往往與納米材料放大技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的雙重放大。

Yuan等[29]將制備的苝四甲酸/卟啉鐵復(fù)合物作為氧化還原探針固定到電極表面，再在其表面通過(guò)納米金修飾凝血酶適體，與氧化石墨烯標(biāo)記的凝血酶適體互補(bǔ)鏈結(jié)合，采用葡萄糖氧化酶代替其他封閉劑固定到電極表面用于信號(hào)的放大（圖3）。該適體傳感器在底液中存在葡萄糖時(shí)，葡萄糖氧化酶首先催化葡萄糖產(chǎn)生過(guò)氧化氫，產(chǎn)生的過(guò)氧化氫進(jìn)一步被苝四甲酸/卟啉鐵復(fù)合物催化，通過(guò)多步催化最終實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)的放大，對(duì)于凝血酶的檢測(cè)限為1 pmol/L。Zhao等[30]制備了一種新型的殼聚糖-納米金復(fù)合物，并用其固載大量的辣根過(guò)氧化物酶和凝血酶適體，采用納米金包裹的磁珠復(fù)合物固載另一段凝血酶適體，當(dāng)目標(biāo)分析物凝血酶存在時(shí)，兩段適體標(biāo)記的復(fù)合物通過(guò)夾心反應(yīng)結(jié)合在一起，然后利用納米磁珠的磁性將所形成的夾心復(fù)合物富集在電極表面，此時(shí)電極表面的辣根過(guò)氧化物酶通過(guò)對(duì)底物過(guò)氧化氫的催化，對(duì)檢測(cè)溶液中電活性物質(zhì)對(duì)苯二酚的氧化還原反應(yīng)起到了增強(qiáng)的作用，從而提高了傳感器的檢測(cè)靈敏度。

圖3 基于模擬雙酶放大的電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[29]Fig.3Schematic diagram of the principle for the electrochemical aptasensor with pseudobienzyme for amplification

除了常用的蛋白酶類(lèi)，Travascio等在1998年首次提出了一種具有G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA酶[31]。這種G-四鏈體DNA酶是由一段富含G堿基的寡核苷酸片段與卟啉鐵配位形成的具有強(qiáng)結(jié)合能力的配合物，具有類(lèi)似于辣根過(guò)氧化物酶的催化活性，因而又被稱(chēng)為辣根過(guò)氧化物模擬酶。與蛋白酶類(lèi)相比，該G-四鏈體DNA酶體積更小，更易于修飾到其它分子上，且穩(wěn)定性好，抗水解能力強(qiáng)，因而成為了一種新型的催化標(biāo)記物。另外，該G-四鏈體DNA酶由于其自身作為核酸，減少了對(duì)于蛋白分子等的非特異性吸附，因而能進(jìn)一步提高傳感器的特異性。Shen等[32]直接將凝血酶適體固定到電極表面，利用凝血酶適體自身含有大量G堿基的這一特性，將其與卟啉鐵結(jié)合形成G-四鏈體DNA酶的催化結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單的電化學(xué)適體傳感器用于檢測(cè)凝血酶。Zhang等[33]設(shè)計(jì)了一條含有大量G堿基的細(xì)胞因子適體，在目標(biāo)物細(xì)胞因子不存在時(shí)，該適體自身部分互補(bǔ)配對(duì)形成發(fā)夾型結(jié)構(gòu)；當(dāng)細(xì)胞因子存在時(shí)，適體與細(xì)胞因子結(jié)合使得發(fā)夾型打開(kāi)，此時(shí)裸露出的一段富含G堿基的序列就能與卟啉鐵結(jié)合形成G-四鏈體DNA酶，利用其對(duì)于過(guò)氧化氫的催化作用成功構(gòu)建了催化放大的電化學(xué)適體傳感器。

2.2.2 親和素-生物素系統(tǒng)放大

親和素（avidin）是一種由4個(gè)相同的亞單元組成的堿性糖蛋白，目前常用的鏈霉親和素（streptavidin）是從鏈霉菌中提取得到的。生物素（biotin）由一個(gè)帶羧基的噻吩環(huán)和一個(gè)咪唑酮環(huán)組成，俗稱(chēng)維生素H。每個(gè)親和素亞單元可以通過(guò)其結(jié)構(gòu)中的色氨酸殘基與生物素中的咪唑酮環(huán)結(jié)合，因此一分子的親和素可以與四分子的生物素進(jìn)行結(jié)合。其結(jié)合的特異性強(qiáng)，親合力往往比抗體抗原作用的親合力高出10～100萬(wàn)倍。Centi等[34]首先將納米磁珠用鏈霉親和素進(jìn)行修飾，這樣在一個(gè)親和素位點(diǎn)上就可以特異性結(jié)合四個(gè)生物素標(biāo)記的凝血酶適體鏈，有效提高了凝血酶適體的固載量，通過(guò)夾心反應(yīng)將另一段堿性磷酸酯酶標(biāo)記的凝血酶適體修飾到電極表面，利用堿性磷酸酯酶有效催化底物水解產(chǎn)生氧化還原物質(zhì)完成對(duì)凝血酶的定量檢測(cè)（圖4）。

2.2.3 滾環(huán)擴(kuò)增放大技術(shù)

圖4 親和素-生物素放大技術(shù)構(gòu)建電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[34]Fig.4Schematic diagram of the principle for the electrochemical aptasensor with biotin-streptavidin affinity for amplification

滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）是環(huán)狀DNA的一種快速?gòu)?fù)制方式，通常以一種有缺口的環(huán)狀單鏈DNA作為模板，以一小段短的單鏈DNA作為引物，該引物可以與部分環(huán)狀模板互補(bǔ)，然后在連接酶和聚合酶的催化作用下將引物DNA恒溫?cái)U(kuò)增延長(zhǎng)，產(chǎn)物為一段長(zhǎng)的單鏈DNA，其中含有大量重復(fù)的與模板DNA互補(bǔ)的DNA片段。這種方法不僅能夠直接將DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于靶核酸的信號(hào)放大，具有非常高的靈敏度。近年來(lái)，將其它放大技術(shù)與該恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)聯(lián)合用于目標(biāo)物的超靈敏檢測(cè)已成為了研究熱點(diǎn)。

Zhou等[35]利用“抗體-目標(biāo)分析物-適體”的夾心反應(yīng)模型設(shè)計(jì)了超靈敏的蛋白質(zhì)分子檢測(cè)方法。首先將一小段單鏈DNA作為滾環(huán)復(fù)制的引物標(biāo)記在血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF-BB）適體的尾端，以帶缺口的環(huán)狀DNA為模板，在DNA聚合酶和連接酶的作用下進(jìn)行恒溫滾環(huán)復(fù)制。復(fù)制完成后再將生物素化的信號(hào)探針與擴(kuò)增后的單鏈DNA的重復(fù)片段結(jié)合，再利用親和素-生物素的親和作用將堿性磷酸酯酶修飾到信號(hào)探針上。檢測(cè)底液中的抗壞血酸磷酸酯在堿性磷酸酯酶的作用下水解產(chǎn)生抗壞血酸，再利用抗壞血酸將溶液中的Ag+還原為Ag，利用線性掃描伏安法定量檢測(cè)還原得到的Ag。通過(guò)多重信號(hào)放大作用，制得超靈敏的電化學(xué)適體傳感器，對(duì)PDGFBB的檢測(cè)限達(dá)到了10 fmol/L（圖5）。隨后，Wu等[36]將一小段DNA標(biāo)記到PDGF適體的尾端，當(dāng)目標(biāo)物PDGF與適體結(jié)合后，適體構(gòu)象發(fā)生折疊使得該小段DNA裸露在外，在Phi29聚合酶的作用下，以該小段DNA為模板合成其互補(bǔ)的DNA片段（與引物DNA序列相同），未與目標(biāo)物結(jié)合的適體則不能合成。加入滾環(huán)擴(kuò)增所需原料后，未與目標(biāo)物結(jié)合的適體上的小段DNA將與新加入的引物DNA互補(bǔ)配對(duì)，使其不能與環(huán)狀模板DNA識(shí)別。而與PDGF結(jié)合后的適體則不影響滾環(huán)擴(kuò)增的進(jìn)行，最后利用固定有捕獲探針的電極收集滾環(huán)擴(kuò)增的長(zhǎng)鏈DNA產(chǎn)物，并通過(guò)靜電作用將電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)結(jié)合到該長(zhǎng)鏈DNA上，通過(guò)測(cè)定電化學(xué)信號(hào)的增加值來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)PDGF的超靈敏檢測(cè)（圖6）。

圖5 基于滾環(huán)擴(kuò)增放大技術(shù)的電化學(xué)適體傳感器原理示意圖[35]Fig.5Schematic diagram of the principle for the electrochemical aptasensor with RCA for amplification

2.2.4 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大技術(shù)

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hybridization chain reaction, HCR）是核酸體外擴(kuò)增技術(shù)的又一重要進(jìn)展，通過(guò)一小段單鏈核苷酸作為引發(fā)劑誘導(dǎo)兩條發(fā)夾型單體交替雜交聚合形成延展的帶有切口的雙鏈DNA，該過(guò)程為無(wú)酶參與的等溫反應(yīng)過(guò)程[37～38]。由于該反應(yīng)是通過(guò)引發(fā)劑觸發(fā)的，因此可以有效地減少假陽(yáng)信號(hào)，降低背景信號(hào)。此外，每個(gè)引發(fā)劑都可以引發(fā)一個(gè)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，因而可以形成大量的長(zhǎng)的雙鏈結(jié)構(gòu)，通過(guò)合理的設(shè)計(jì)與修飾，能有效地放大檢測(cè)信號(hào)。Zhang等[39]將該技術(shù)運(yùn)用到電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建中用于目標(biāo)抗原IgG的超靈敏檢測(cè)。首先通過(guò)交聯(lián)劑將一抗交聯(lián)到氨基化的納米磁珠表面，二抗采用納米金標(biāo)記，并在該納米金表面修飾上單鏈核苷酸S1作為雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，通過(guò)夾心免疫反應(yīng)將一抗復(fù)合物-目標(biāo)物IgG-二抗復(fù)合物結(jié)合到一起，在外加磁場(chǎng)的作用下將該夾心復(fù)合物富集到ITO電極表面，然后與兩條電活性物質(zhì)二茂鐵標(biāo)記的發(fā)夾型適體發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使得電極表面富含大量的二茂鐵標(biāo)記的聚合雙鏈結(jié)構(gòu)，從而得到增強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)。

圖7 基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶標(biāo)記信號(hào)放大的電化學(xué)適體傳感器[41]Fig.7Schematic diagram of the electrochemical aptasensor with hybridization chain reaction and enzyme for amplification

Chen等[40]利用目標(biāo)DNA作為引發(fā)劑，誘發(fā)兩條發(fā)夾型單體在電極表面通過(guò)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到長(zhǎng)的雙鏈DNA，再將發(fā)光物質(zhì)鄰二氮菲釕Ru(phen)32+嵌入到雙鏈DNA中，制得了免標(biāo)記型電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器，HCR反應(yīng)得到的長(zhǎng)的聚合雙鏈結(jié)構(gòu)極大地增強(qiáng)了Ru(phen)32+捕獲量，從而有效地提高了傳感器的靈敏度。Zhao等[41]將雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與酶標(biāo)記信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了電化學(xué)適體傳感器用于干擾素的檢測(cè)（圖7）。該工作巧妙地設(shè)計(jì)了一段識(shí)別序列，該識(shí)別序列的下半段為與干擾素結(jié)合的適體序列，并且該適體序列能與固定到電極表面的捕獲探針互補(bǔ)，上半段為雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)序列。當(dāng)不存在目標(biāo)物干擾素時(shí)，識(shí)別序列可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)修飾到電極表面，在引發(fā)序列的作用下與兩條生物素標(biāo)記的發(fā)夾型單體發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而可以通過(guò)生物素-親和素作用將大量的堿性磷酸酯酶標(biāo)記到雙鏈上，利用該酶催化非電活性的底物1-萘基磷酸鹽水解產(chǎn)生電活性的1-萘酚而得到放大的電化學(xué)信號(hào)。而隨著干擾素濃度的增大，能結(jié)合到電極表面的識(shí)別序列的量減少，使得相應(yīng)的電化學(xué)信號(hào)依次減小，利用電流響應(yīng)的變化值，成功構(gòu)建了催化放大體系用于目標(biāo)物干擾素的檢測(cè)。

2.2.5 目標(biāo)循環(huán)放大技術(shù)

基于核酸剪切酶誘導(dǎo)的目標(biāo)循環(huán)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種信號(hào)放大技術(shù)，由于其打破了傳統(tǒng)的適體與目標(biāo)物1∶1結(jié)合的局限，被越來(lái)越多地用于高靈敏的生物分析中[42～47]。該目標(biāo)循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)是利用剪切酶將與目標(biāo)物或目標(biāo)鏈結(jié)合的核苷酸鏈切斷，從而將目標(biāo)物或目標(biāo)鏈釋放，釋放出的目標(biāo)物或目標(biāo)鏈再進(jìn)行下一個(gè)結(jié)合和剪切的循環(huán)過(guò)程，經(jīng)過(guò)目標(biāo)物不斷的重復(fù)利用，達(dá)到信號(hào)放大的效果。

Tong等[48]將一端標(biāo)記電活性物質(zhì)二茂鐵的赫曲毒素（OTA）適體互補(bǔ)鏈修飾到金電極表面，再與OTA適體互補(bǔ)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，此時(shí)二茂鐵離電極表面的距離較遠(yuǎn)，電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)較小，當(dāng)目標(biāo)分析物OTA存在時(shí)，適體與目標(biāo)物特異結(jié)合后脫離電極表面，脫離電極表面的適體可以在外切酶的作用下被剪斷，釋放出的目標(biāo)物又可以參與下一個(gè)循環(huán)與更多的適體結(jié)合，因而在電極表面獲得大量的適體互補(bǔ)鏈，此時(shí)標(biāo)記的二茂鐵分子通過(guò)堿基互補(bǔ)與電極表面的距離變近，獲得增強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)，從而成功構(gòu)建了signal-on型電化學(xué)適體傳感器（圖8）。Hsieh等[49]在電極表面設(shè)計(jì)了一段發(fā)夾型的DNA探針，其環(huán)形部分的頂端標(biāo)記電活性亞甲基藍(lán)分子（MB），此時(shí)由于MB與電極的距離較大使得電化學(xué)信號(hào)較小，當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí)，發(fā)夾型結(jié)構(gòu)打開(kāi)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，該雙鏈結(jié)構(gòu)在剪切酶的作用下被剪短，使得MB離電極表面的距離變小，同時(shí)釋放出的目標(biāo)DNA參與下一循環(huán)打開(kāi)更多的發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，使得電極表面MB的電化學(xué)信號(hào)得以增強(qiáng)。

圖8 基于核酸外切酶誘導(dǎo)目標(biāo)循環(huán)信號(hào)放大的電化學(xué)適體傳感器[48]Fig.8Schematic diagram of the electrochemical aptasensor with exonuclease-catalyzed target recycling for amplification

另外一種實(shí)現(xiàn)目標(biāo)循環(huán)的方法是基于聚合酶的循環(huán)鏈置換聚合酶反應(yīng)（circular strandreplacement polymerization，CSRP）。該反應(yīng)首先要設(shè)計(jì)一種發(fā)夾型的DNA核酸探針，作為目標(biāo)核酸鏈和聚合酶的反應(yīng)模板，當(dāng)目標(biāo)核酸鏈與發(fā)夾型探針特異性結(jié)合后，模板探針發(fā)夾型結(jié)構(gòu)打開(kāi)變?yōu)榫€型，作為DNA聚合酶反應(yīng)的模板，在引物和聚合酶作用下引發(fā)聚合酶反應(yīng)，同時(shí)由于聚合酶的鏈置換活性，使誘導(dǎo)發(fā)夾型核酸構(gòu)象變化的目標(biāo)核酸鏈能從聚合酶反應(yīng)中被置換釋放出來(lái)，重新誘導(dǎo)參與下一輪的聚合酶反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)核酸鏈的循環(huán)放大[50]。Ren等[51]將一段癌細(xì)胞適體固定到納米磁珠表面，與目標(biāo)鏈互補(bǔ)配對(duì)，當(dāng)目標(biāo)分析物癌細(xì)胞存在時(shí)，癌細(xì)胞與適體特異性結(jié)合，使得目標(biāo)鏈被釋放。釋放的目標(biāo)鏈與電極表面設(shè)計(jì)的發(fā)夾型核酸探針結(jié)合并打開(kāi)其發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，同時(shí)將引物鏈和大量核苷酸標(biāo)記的納米金結(jié)合到探針上，在聚合酶和脫氧核苷三磷酸（dNTP）的作用下啟動(dòng)聚合反應(yīng)，與此同時(shí)將目標(biāo)鏈置換出來(lái)誘導(dǎo)新一輪的聚合反應(yīng)，目標(biāo)鏈的循環(huán)使得電極表面帶有大量核苷酸標(biāo)記的納米金，利用其捕獲電化學(xué)的六氨合釕，得到放大的電化學(xué)信號(hào)（圖9）。

圖9 基于CSRP誘導(dǎo)目標(biāo)循環(huán)信號(hào)放大的電化學(xué)適體傳感器[51]Fig.9Schematic diagram of the electrochemical aptasensor with CSRP-catalyzed target recycling for amplification

Gao等[52]利用循環(huán)鏈置換聚合酶反應(yīng)誘導(dǎo)的目標(biāo)物循環(huán)和納米金催化銀沉積的雙重信號(hào)放大構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器用于DNA的超靈敏檢測(cè)（圖10）。首先在殼聚糖修飾的玻碳電極表面通過(guò)戊二醛將氨基標(biāo)記的發(fā)夾型核酸探針固定到電極表面，該核酸探針同樣作為目標(biāo)物和聚合酶反應(yīng)的模板。首先通過(guò)目標(biāo)DNA將核酸探針的發(fā)夾型結(jié)構(gòu)打開(kāi)，再與引物標(biāo)記的納米金結(jié)合，在聚合酶和dNTP的作用下啟動(dòng)聚合酶反應(yīng)，同時(shí)將目標(biāo)DNA釋放出來(lái)打開(kāi)更多的發(fā)夾型核酸探針以誘導(dǎo)更多的聚合酶反應(yīng)，使得大量的納米金被引入電極表面，納米金促進(jìn)銀沉積的線性掃描伏安曲線則給出了定量的依據(jù)。將這兩種放大策略相結(jié)合，使得傳感器具有很高的選擇性和靈敏度，對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)限為0.03 fmol/L。

3 結(jié)論

將適體作為分子識(shí)別元件與電化學(xué)生物傳感器相結(jié)合而構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器，集合了適體和電化學(xué)傳感器的優(yōu)勢(shì)，不僅具有適體的高選擇性和特異性，也具有電化學(xué)傳感器的高靈敏、快響應(yīng)、低成本等優(yōu)點(diǎn)。利用納米材料獨(dú)特的電化學(xué)、光學(xué)性質(zhì)及其良好的催化活性，能夠有效地增強(qiáng)電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)；生物放大技術(shù)由于其穩(wěn)定性好，專(zhuān)屬特異性高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)分析中的信號(hào)放大。將新型的納米材料放大技術(shù)與新型的生物放大技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)一步提高電化學(xué)適體傳感器的靈敏度并改善其特異性和重現(xiàn)性；研究微型化、高通量的適體傳感器，推廣其在醫(yī)學(xué)診斷、藥物篩選等方面的實(shí)際應(yīng)用，都將會(huì)是適體傳感器發(fā)展的主要方向。

圖10 基于CSRP誘導(dǎo)目標(biāo)循環(huán)和納米金催化的銀沉積雙重信號(hào)放大檢測(cè)DNA[52]Fig.10Schematic diagram of dual signal amplification strategy for DNA detection by CSRP and AuNPs catalyzed silver deposition

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Proceedings of signal amplification strategies applied in electrochemical aptasensors

Bai Li-juan,Yuan Ruo*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

Electrochemical aptasensors used for quantitative detection of target analytes are based on the changes of electrochemical signals before and after the binding between aptamers and target analytes,which hold the advantages of simple operation,rapid response,high sensitivity and good selectivity.In order to further improve the sensitivity of the biosensor,enhance the detection signal become the common method for researchers in construction of electrochemical aptasensor.Using a variety of amplification technology such as nanomaterials,biological and chemical methods,could effectively enhance the detection signal and reduce the noise signal,which holds great significance in improvement the sensitivity of the aptasensor.The principle of electrochemical aptasensor is presented,and the proceedings of signal amplification strategies applied in electrochemical aptasensors during the last ten years are extensively reviewed.

signal amplification;electroanalysis;aptamer;biosensor;review

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21275119,21075100)

*通訊聯(lián)系人，E-mail：yuanruo@swu.edu.cn