肖麗娟，孫 娟，柴雅琴

(西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶現(xiàn)代分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400715)

0 引言

凝血酶是凝血過程中一種重要的絲氨酸蛋白酶，可以加速和鞏固凝血過程，調(diào)控炎癥和傷口愈合速度，其濃度和活性在許多發(fā)病機(jī)理如白血病，動(dòng)脈血栓癥等中占主導(dǎo)作用，對(duì)凝血酶的分析檢測(cè)在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)上具有重要的意義[1]。在眾多生物傳感檢測(cè)方法中，電化學(xué)適體傳感器因具有靈敏度高、分析速度快、操作便利、成本低廉、易于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)凝血酶的快速準(zhǔn)確檢測(cè)[2～3]。非標(biāo)記型電化學(xué)適體生物傳感器無需對(duì)適體進(jìn)行標(biāo)記，直接根據(jù)適體識(shí)別前后引起電阻、電流或電位的變化進(jìn)行檢測(cè)的傳感器。這類傳感器的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)檢測(cè)方便、假信號(hào)率低，對(duì)適體的活性沒有損傷[4～5]。

石墨烯（graphene）是一種由sp2雜化的單層碳原子以六邊形排列形成的周期性蜂窩狀二維碳質(zhì)新材料。獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)使得石墨烯在力學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)等方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。例如石墨烯具有大的比表面積、超強(qiáng)的電子傳導(dǎo)能力、優(yōu)異的熱導(dǎo)率和穩(wěn)定性[6～7]。一維結(jié)構(gòu)的碳納米管（carbon nanotubes）也具有大的比表面積、超強(qiáng)的機(jī)械性能、良好的導(dǎo)電能力和吸附性能[8～9]。這些特點(diǎn)使得碳材料在作為電化學(xué)傳感器的固載基質(zhì)用于放大信號(hào)和提高檢測(cè)靈敏度等方面展現(xiàn)出誘人的前景。

基于此，該文構(gòu)建了一個(gè)高靈敏非標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。殼聚糖（CS）由于其具有出色的分散能力和成膜能力[10]，易于形成殼聚糖/碳納米管/石墨烯/鐵氰化鎳 （CSCNTs-Gra-FP）納米復(fù)合材料以提高電活性物質(zhì)FP的固載量。其中，石墨烯和碳納米管的加入，不僅增大了電極的比表面積，而且促進(jìn)了電子的傳輸速率。其次，在適體傳感器的制備過程中通過沉積方法引入納米金粒子 （nano-Au）用于凝血酶適體的固載，nano-Au大的比表面積和強(qiáng)的催化能力能夠起到放大電化學(xué)反應(yīng)信號(hào)和降低檢測(cè)限的作用[11]。根據(jù)此原理制備的適體傳感器能夠準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)凝血酶。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI600a電化學(xué)工作站 （上海辰華儀器公司）；超聲波清洗儀DS-1510DT（上海生析超聲儀器有限責(zé)任公司）；實(shí)驗(yàn)采用的三電極體系，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑電極為輔助電極，修飾的玻碳電極（GCE，φ=4mm）為工作電極。

碳納米管（CNTs）、石墨烯（Gra）（中國(guó)南京先豐納米材料科技有限公司）；殼聚糖（CS）、氯金酸（HAuCl4）、 鐵氰化鎳 （FP）（美國(guó) Sigma 公司）；NiCl2·6H2O、K3Fe(CN)6（中國(guó)四川化學(xué)制品公司）；凝血酶適體（TBA）、凝血酶（TB）（中國(guó)大連寶生生物公司）；牛血清蛋白（BSA）、甲胚蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）（中國(guó)鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）。 磷酸緩沖溶液（PBS,pH=7.0,0.1 mol/L）由 0.1 mol/L Na2HPO4、0.1 mol/L KH2PO4、0.1 mol/L KCl配制而成。三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（Tris-HCl,pH=7.4,20 mmol/L）用 140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2制備。 相關(guān)試劑均為分析純，及時(shí)制備使用，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 鐵氰化鎳的制備

鐵氰化鎳的合成步驟如下：首先，將20 mL 0.01 mol/L NiCl2溶液逐滴加到 20 mL 含有 0.05 mol/L KCl的 0.05 mol/L K3Fe(CN)6溶液中，滴加完畢后，繼續(xù)劇烈攪拌5min。然后，將所得混合液立即進(jìn)行高速離心并用二次蒸餾水洗滌幾次。最后，將黃色沉淀物分散在 20 mL PBS（pH=7.0）的溶液中，密封備用。

1.3 CS-CNTs-Gra-FP納米復(fù)合材料的制備

首先，分別取碳納米管1 mg、石墨烯1 mg，將其分散在2 mL 0.5 mg/mL的殼聚糖溶液中。將得到的混合物超聲處理幾個(gè)小時(shí)以獲得均勻分散的CS-CNTs-Gra復(fù)合物。隨后，將CS-CNTs-Gra復(fù)合物與鐵氰化鎳（FP）以1∶5的比例混合均勻，得到CS-CNTs-Gra-FP納米復(fù)合材料。

1.4 適體傳感器的制備

分別 用 粒徑為 0.3 μm 和 0.05 μm 的 Al2O3粉把玻碳電極（GCE）拋光成鏡面，然后用二次蒸餾水、無水乙醇、二次蒸餾水超聲洗滌5 min，清洗后的電極置于室溫下晾干。

首先，用5 μL CS-CNTs-Gra-FP對(duì)電極進(jìn)行修飾，在室溫晾干成膜后，將電極浸沒在1%的HAuCl4溶液中，用電化學(xué)沉積的方法在電極表面修飾上一層納米金（nano-Au）。隨后，在該電極上滴加 20 μL TBA（2 μmol/L），在室溫下孵育 16 h。再滴加20 μL BSA （1%），在室溫下孵育40 min以封閉電極表面的非特異性吸附位點(diǎn)。最后，滴加20 μL不同濃度的TB，室溫下孵育50 min，即可用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。該適體傳感器的制備過程示意圖如圖1。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

該實(shí)驗(yàn)測(cè)量電極電流采用三電極系統(tǒng)：將制備好的電化學(xué)適體傳感器作為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極。采用循環(huán)伏安法（CV）對(duì)電極的制備過程進(jìn)行檢測(cè)。以 2 mL PBS（pH=7.0）緩沖液作為檢測(cè)底液，掃描電位在 0.1～0.8 V 范圍內(nèi)， 以 100 mV/s的速度進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，實(shí)驗(yàn)均在室溫條件下進(jìn)行。

圖1 適體傳感器的制備過程Fig.1 The fabrication progress of the electrochemical aptasensor

2 結(jié)果與討論

2.1 適體傳感器的電化學(xué)表征

圖2 電極在0.1 mol/L PBS(pH=7.0)溶液中的循環(huán)伏安表征曲線。(a)裸的玻碳電極；(b)CS-CNTs-Gra-FP修飾的電極；(c)nano-Au/CS-CNTs-Gra-FP修飾的電極；(d)固定了TBA的電極；(e)經(jīng)BSA封閉的電極；(f)與TB孵育后的電極Fig.2 The CVs of different modified electrodes in 0.1 mol/L PBS solution(pH=7.4);(a)GCE,(b)CS-CNTs-Gra-FP/GCE,(c)nano-Au/CS-CNTs-Gra-FP/GCE,(d)TBA/nano-Au/CSCNTs-Gra-FP/GCE,(e)BSA/TBA/nano-Au/CS-CNTs-Gra-FP/GCE,(f)TB/BSA/TBA/nano-Au/CS-CNTS-Gra-FP/GCE

為了研究修飾電極表面電化學(xué)性質(zhì)的變化，采用循環(huán)伏安法（CV）對(duì)不同步驟下的電極進(jìn)行了電化學(xué)表征，如圖2所示。曲線a為裸電極的循環(huán)伏安圖，因無電活性物質(zhì)，故無氧化還原峰；當(dāng)CS-CNTs-Gra-FP復(fù)合物修飾到電極表面后，在0.4 V左右出現(xiàn)一對(duì)可逆性好的氧化還原峰（曲線b）；曲線c表示nano-Au修飾后電極的循環(huán)伏安圖，因?yàn)閚ano-Au易于傳輸電子，所以峰電流值增大；孵育TBA后的電極，峰電流值明顯降低 （曲線d），這是由于TBA阻礙了電子的傳遞；當(dāng)用大分子蛋白質(zhì)BSA封閉電極上的非特異性吸附位點(diǎn)后，峰電流值進(jìn)一步減?。ㄇ€e）；曲線f為孵育10 nmol/L TB后電極循環(huán)伏安圖，由于TB對(duì)電極表面電子傳輸?shù)倪M(jìn)一步阻礙，使得氧化還原峰電流值再次減小。

2.2 不同掃描速度對(duì)適體傳感器的影響

將已完整修飾的電極在pH=7.0的PBS檢測(cè)液中用循環(huán)伏安法進(jìn)行變速掃描，掃描速度改變，相應(yīng)的峰電流值也發(fā)生變化。掃描速度與相對(duì)應(yīng)的峰電流值的關(guān)系如圖3（從內(nèi)至外的掃描速 度 依 次 為 10、20、50、80、100、120、150、180、200、250、300、350、400 mV/s）。 由圖可知，隨著掃描速度從10 mV/s～400 mV/s不斷變化，峰電流值也不斷增大，且與掃描速度的平方根成正比，說明電極表面呈擴(kuò)散控制。

2.3 適體傳感器的電流響應(yīng)特性

用 pH=7.4的 Tris-HCl溶液配置濃度為0.01、0.1、1、5、10、15、20、30 nmol/L 的 凝 血 酶 溶液。由低濃度到高濃度依次向BSA封閉后的電極滴加20 μL凝血酶溶液，各孵育50 min后，置于pH=7.0的PBS溶液中進(jìn)行CV測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如下所示：

圖3 （A）不同掃描速度對(duì)適體傳感器的影響（B）峰電流和掃描速度平方根的線性關(guān)系Fig.3 (A)Cyclic voltammograms of the electrochemical aptasensor at different scan rate;(B)The plot of redox peak currents vs.square root of scan rate

由圖4可以看出，在測(cè)定不同濃度的TB溶液時(shí)，峰電流的信號(hào)有了不同程度的減弱。其原因是TB是蛋白質(zhì)大分子，并且與TBA特異性結(jié)合，阻礙了電子的傳輸，使得電流響應(yīng)信號(hào)減小。圖4表明TB濃度在0.01～30 nmol/L范圍內(nèi)，該適體傳感器的峰電流值與其具有良好的線性關(guān)系，線性方程為：I/μA=22.01 g(c/(nmol/L))-135.4，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，檢測(cè)下限為 0.003 nmol/L。

圖4 適體傳感器對(duì)不同濃度的TB的定量檢測(cè)Fig.4 Quantitative analysis of the aptamsensor for TB

2.4 適體傳感器穩(wěn)定性的測(cè)定

在掃描速度為100 mV/s下，將BSA封閉后的電極在PBS檢測(cè)液中進(jìn)行100圈循環(huán)伏安掃描。得到的循環(huán)伏安曲線如圖5所示：峰電流值變化值為3.23%（＜5%），表明電極具有良好的穩(wěn)定性。主要原因是由于CS-CNTs-Gra-FP納米復(fù)合物以及金納米粒子單層膜修飾的電極具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 適體傳感器選擇性的測(cè)定

圖5 適體傳感器穩(wěn)定性的測(cè)定Fig.5 Stability analysis of the electrochemical aptasensor

為了研究適體傳感器的選擇性，選用了三種可能的干擾蛋白物質(zhì)BSA、CEA、AFP進(jìn)行測(cè)定。修飾電極表面分別與 20 μL BSA+TB、CEA+TB、AFP+TB、TB（10 nmol/L）、Tris（pH=7.4）孵育 50 min。然后將上述電極置于pH=7.0的PBS檢測(cè)液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定，結(jié)果如圖6所示：Tris-HCl溶液孵育后的電極峰電流值基本沒發(fā)生改變，與上一步BSA封閉后的電極峰電流值差距ΔI很小，說明其對(duì)該適體傳感器的干擾性較小，或是無干擾。 而 BSA+TB、CEA+TB、AFP+TB、TB孵育后的電極峰電流值與上一步BSA封閉后的電極峰電流值差距很大，但其峰電流值相差不大，歸因于TB阻礙了電子的傳遞，使得電流響應(yīng)信號(hào)減小，峰電流值也相應(yīng)地減小，因此可以認(rèn)為BSA、CEA、AFP對(duì)該適體傳感器的干擾性較小。綜上所述，該適體傳感器具有良好的選擇性。

圖6 適體傳感器選擇性的測(cè)定Fig.6 Selectivity determination of the electrochemical aptasensor

2.6 適體傳感器的應(yīng)用

為了評(píng)估所構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器在臨床診斷的可行性，用標(biāo)準(zhǔn)添加的方法做了回收率實(shí)驗(yàn)。即將人體血清與Tris-HCl溶液按1∶50的比例進(jìn)行稀釋，然后用稀釋后的人體血清配制濃度成不同濃度的凝血酶溶液。結(jié)果如表1所示：回收率為90%～110%，在可接受的范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)表明該適體傳感器在臨床診斷中具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

該文成功構(gòu)建了一個(gè)非標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器用于凝血酶的高靈敏檢測(cè)。其中CSCNTs-Gra-FP納米復(fù)合材料提高了電活性物質(zhì)FP的固載量，增強(qiáng)了電極的電化學(xué)響應(yīng)。碳納米管、石墨烯和納米金的引入不僅增大了電極的比表面積，也增強(qiáng)了電子的傳輸速率，從而有效提高了該傳感器的靈敏度。此外，該傳感器還具有穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)。

表1 人體血清樣品的加標(biāo)回收Tab.1 The recovery of human serum samples

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