劉遵春,馮愛英,扈惠靈

（1.河南科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003；2.洪官屯鎮(zhèn)聯(lián)合校,山東 茌平 252114）

柿樹葉片葉綠素含量測(cè)定方法比較研究

劉遵春1,馮愛英2,扈惠靈1

（1.河南科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003；2.洪官屯鎮(zhèn)聯(lián)合校,山東 茌平 252114）

以甜柿與澀柿葉片為試材,采用3種不同有機(jī)溶劑作為提取液,比較研究了甜柿和澀柿2種柿樹葉片葉綠素含量的測(cè)定方法.結(jié)果表明：采用研磨法提取葉綠素時(shí),溶劑以體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇最好,甜柿葉片葉綠素總含量、葉綠素a含量和葉綠素b含量分別為1.428、1.086和0.341 mg/g,澀柿葉片葉綠素總含量、葉綠素a含量和葉綠素b含量分別為0.951、0.737和0.213 mg/g,均顯著高于體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮和二者的混合液；采用浸泡法提取葉綠素時(shí),以體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮和體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇按體積比1∶1混合的混合液提取效果最好,甜柿葉片葉綠素總含量、葉綠素a含量和葉綠素b含量分別為1.478、1.089和0.388 mg/g,澀柿葉片葉綠素總含量、葉綠素a含量和葉綠素b含量分別為1.180、0.886和0.294 mg/g,均顯著高于體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇和體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮.兩種葉綠素提取方法比較發(fā)現(xiàn),浸泡法優(yōu)于研磨法.

柿樹；葉綠素；有機(jī)溶劑；研磨法；浸泡法

柿屬柿樹科柿樹屬,原產(chǎn)我國(guó),有3 000多年的栽培歷史,是我國(guó)一種廣為栽培的古老經(jīng)濟(jì)樹種.葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì),同時(shí)葉綠素的含量也是植物重要的生理指標(biāo)之一.因此,對(duì)柿樹葉綠素提取方法的研究意義重大[1-2].早期國(guó)際上廣泛采用Arnon法測(cè)定葉綠素含量[3],但該方法由于先研磨后過濾,工作量大,步驟多,且容易受光氧化而引起測(cè)量誤差,更不適宜于田間大量樣品的測(cè)定[4].為此,人們不斷研究改進(jìn)葉綠素的測(cè)定方法[5-7].洪法水等研究認(rèn)為,用丙酮和乙醇的混合液提取植物葉片葉綠素比單一提取液效果要好[8].孫俊寶等分別對(duì)體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇和不同配比混合液的浸提效果進(jìn)行了深入的研究,得出最適宜提取櫻桃葉片葉綠素的混合液為體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮和體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇按體積比1∶1混配的混合液,最佳浸提時(shí)間為14 h[9].鄧祥元等通過比較不同溶劑及其濃度（體積）、不同萃取時(shí)間對(duì)桑葉葉綠素萃取效率的影響發(fā)現(xiàn),將丙酮與無水乙醇混合使用可顯著提高葉綠素的萃取效率[10].麻明友等采用不同比例的丙酮、乙醇混合試劑,直接浸泡提取獼猴桃葉片葉綠素,發(fā)現(xiàn)在35℃、浸泡14 h、液料比=12∶1時(shí),葉綠素提取效果最佳[11].

本試驗(yàn)利用體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇和丙酮-乙醇混合液（體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮與體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇按體積比1∶1混合）等3種提取液,結(jié)合研磨法和浸泡法2種提取方法,對(duì)測(cè)定柿樹葉片葉綠素含量的效果進(jìn)行了比較研究,旨在為大量柿樹葉片樣本葉綠素含量的測(cè)定提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用甜柿和澀柿葉片均采自河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院古固寨教學(xué)實(shí)習(xí)基地,每個(gè)品種分別采取長(zhǎng)枝中上部發(fā)育良好、無病蟲害的葉片20片.

1.2 試劑與儀器

丙酮、乙醇（均為分析純）；百分之一天平（上海精天電子儀器有限公司）,722型可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 研磨法 在試驗(yàn)田選取生長(zhǎng)發(fā)育正常、無病蟲害的甜柿與澀柿的葉片各20片,將其用蒸餾水洗凈,用濾紙吸干,剪去主脈,準(zhǔn)確稱取0.2 g葉片置于研缽中,加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇2～3 mL及少量的石英砂研磨至勻漿,然后將研磨后的樣品過濾到25 mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇清洗研缽、濾紙和雜質(zhì)至純白色,洗液濾入容量瓶中,最后分別用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇定容到25 mL,上下顛倒充分混勻,用722型可見光分光光度計(jì)分別在645 nm和663 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值,重復(fù)3次.分別用體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮和丙酮-乙醇混合液作對(duì)比試驗(yàn).

1.3.2 浸泡法 在試驗(yàn)田選取生長(zhǎng)發(fā)育正常、無病蟲害的甜柿與澀柿的葉片各20片,將其用蒸餾水洗凈,用濾紙吸干,剪去主脈,準(zhǔn)確稱取0.2 g葉片,迅速剪碎置于50 mL小燒杯中,加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇,置于黑暗處浸泡12 h,并不時(shí)搖晃.12 h后,取出待測(cè)樣品,將上清液倒入25 mL容量瓶中,最后用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇定容至25 mL,上下顛倒充分混勻,用722型可見光分光光度計(jì)分別在645 nm和663 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值,重復(fù)3次.并用體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮和丙酮-乙醇混合液作對(duì)比試驗(yàn).

根據(jù)Lamber-Beer定律,葉綠素a、葉綠素b與不同波長(zhǎng)下光密度值之間的關(guān)系式如下：

式中,A645、A663分別為相應(yīng)波長(zhǎng)下的光密度值,V為提取液的體積,m為葉片質(zhì)量.

2 結(jié)果與分析

2.1 采用研磨法不同試劑對(duì)柿樹葉片葉綠素提取的效果比較

采用研磨法不同試劑對(duì)柿樹葉片葉綠素提取的影響結(jié)果見表1.

由表1可知,采用研磨法提取甜柿葉片葉綠素時(shí),3種不同試劑提取效果存在很大的差異.其中以體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇提取的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量最高,分別達(dá)到1.086、0.341和1.428 mg/g,顯著或極顯著高于其他兩種試劑；以用體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮提取的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠含量最低,分別為0.551、0.187和0.739 mg/g.在澀柿葉片葉綠素提取中也表現(xiàn)出類似的變化規(guī)律.

表1 采用研磨法不同試劑對(duì)柿樹葉綠素提取的影響Tab.1 Effect of different agents on chlorophyll extraction by grinding method mg/g

2.2 采用浸泡法不同試劑對(duì)柿樹葉片葉綠素提取的效果比較

采用浸泡法不同試劑對(duì)柿樹葉片葉綠素提取的影響見表2.

表2 采用浸泡法不同試劑對(duì)柿樹葉綠素提取的影響Tab.2 Effect of different agents on chlorophyll extraction by soaking methodm g/g

由表2可知,采用浸泡法提取甜柿葉片葉綠素時(shí),3種不同試劑提取效果存在很大的差異.其中以體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮和體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇按體積比1∶1的混合液提取效果最好,總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b含量分別達(dá)到1.478、1.089和0.388 mg/g,顯著或極顯著高于單獨(dú)使用一種試劑時(shí)的提取效果；以單獨(dú)使用體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮提取柿樹葉綠素含量效果最差,葉綠素含量分別僅為1.032、0.813和0.219 mg/g.在澀柿葉片葉綠素提取中也表現(xiàn)出類似的變化規(guī)律.

2.3 兩種方法提取柿樹葉片葉綠素的效果比較

由表1和表2可知,采用2種不同提取方法提取柿樹葉片葉綠素時(shí),提取效果存在一定的差異.比較發(fā)現(xiàn),無論對(duì)甜柿還是澀柿,采用3種不同試劑提取的效果均表現(xiàn)出浸泡法優(yōu)于研磨法.因此,浸泡法更適于快速準(zhǔn)確地提取柿樹葉片葉綠素.

3 小結(jié)與討論

分光光度法測(cè)定植物葉片葉綠素含量,由于所用提取溶劑不同,測(cè)定結(jié)果差異顯著[12].一種好的提取溶劑應(yīng)該提取速度快,葉綠素得率高,穩(wěn)定性好,測(cè)定結(jié)果精密度高.本試驗(yàn)結(jié)果表明,在室溫下用研磨法和浸泡法提取柿樹葉片葉綠素,不同提取液表現(xiàn)出不同的趨勢(shì)：采用研磨法時(shí),體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇提取葉綠素快而完全,表現(xiàn)最好；采用浸泡法提取葉綠素時(shí),體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮和體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇按體積比1∶1的混合液提取效果最好.同時(shí)比較2種提取方法發(fā)現(xiàn),研磨法提取葉綠素時(shí),要經(jīng)過30 min到1 h才能過濾完畢,由于曝光時(shí)間長(zhǎng),葉綠素受光氧化破壞,在過濾時(shí)又被濾紙吸附了部分葉綠素,不能完全洗滌干凈,因此用研磨法得出的結(jié)果偏低；而浸泡法不僅大大提高了提取速度,得率上也優(yōu)于研磨法,這對(duì)于測(cè)定大量樣品葉綠素含量具有實(shí)際意義.因此,采用浸泡法,利用體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮和體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇按體積比1∶1的混合液提取柿樹葉片葉綠素為最佳方法.

參考文獻(xiàn)：

[1] 賀軍虎,王永熙,王容花,等.渭北旱區(qū)幾種柿樹光合特性及其適應(yīng)性的研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2003,18（3）：13-15.

[2] 張國(guó)良,安連榮,代煥琴,等.柿幼樹光合特性的初步研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,23（3）：51-53.

[3] 蘇正淑,張憲政.幾種測(cè)定植物葉綠素含量的方法比較[J].植物生理學(xué)通訊,1989（5）：77-78.

[4] 孟慶廷.葉綠素提取方法及穩(wěn)定性研究進(jìn)展[J].河北化工,2009,32（3）：2-3.

[5] 李得孝,侯萬偉,員海燕.玉米葉片葉綠素快速浸提方法研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2006,34（11）：65-67.

[6] 明華,胡春勝.浸提法測(cè)定玉米葉綠素含量的改進(jìn)[J].玉米科學(xué),2007,15（4）：93-95,99.

[7] 徐邦發(fā),徐雅麗.棉花葉片的葉綠素含量測(cè)定[J].塔里木農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),1995（2）：29-32.

[8] 洪法水,魏正貴,趙貴文.菠菜葉綠素的浸提和協(xié)同萃取反應(yīng)[J].應(yīng)用化學(xué),2001,18（7）：532-535.

[9] 孫俊寶,王建新.櫻桃葉綠素含量測(cè)定方法研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38（3）：18-19,33.

[10] 鄧祥元,高坤,張麗娟.不同溶劑萃取桑葉葉綠素效率的初步研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27（2）：389-394.

[11] 麻明友,麻成金,肖桌柄,等.獼猴桃葉中葉綠素的提取研究[J].食品工業(yè)科技,2006,27（6）：140-143.

[12] 楊振德.分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素含量的探討[J].廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,15（2）：145-150.

（責(zé)任編輯：鄧天福）

Study on chlorophyll extraction methods of leaf in persimmon

Liu Zunchun1,Feng Aiying2,Hu Huiling1
（1.Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China；2.School of Hongguantun Twon,Chiping 252114,China）

With sweet persimmon and astringent persimmon leaves as experimental material,the effects of three extraction solvents and two extraction methods on chlorophyll content were studied.The results showed that,when the chlorophyII was extracted by grinding method,the extraction efficiencies by using 95%ethanol alone were better than mixed solvent or 80%acetone alone.The content of total chlorophyll,chlorophyll a,chlorophyll b in sweet persimmon leaves was 1.428 mg/g,1.086 mg/g,and 0.341 mg/g respectively；The content of total chlorophyll,chlorophyll a, chlorophyll b in astringent persimmon leaves was 0.951 mg/g,0.737 mg/g,and 0.213 mg/g respectively.When the chlorophyll was extracted by soaking method,the extraction efficiencies by using mixed solvent were better than 95% ethanol or 80%acetone alone.The content of total chlorophyll,chlorophyll a,chlorophyll b in sweet persimmon leaves was 1.478 mg/g,1.089 mg/g and 0.388 mg/g respectively；The content of total chlorophyll,chlorophyll a,chlorophyll b in astringent persimmon leaves was 1.180 mg/g,0.886 mg/g,and 0.294 mg/g respectively.When the extraction efficiencies by grinding method was compared with that by soaking method,the latter was better.

persimmon；chlorophyll；organic solvent；grinding method；soaking method

S665.2

A

1008-7516（2014）03-0012-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.03.003

2014-02-11

NSFC-河南聯(lián)合基金（U1304323）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（14A210021）；河南科技學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金（2011014）

劉遵春（1976-）,男,山東聊城人,博士,講師.主要從事果樹栽培教學(xué)及研究.