魏巍　余夢瑤　許曉燕　江南等

摘要[目的]研究中藥材靈芝袋料栽培技術(shù)，以提升靈芝藥材品質(zhì)。[方法]以靈芝生物轉(zhuǎn)化率、多糖含量和三萜含量為指標(biāo)，采用混料設(shè)計(jì)優(yōu)化袋料栽培靈芝主料配方，采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化石灰添加量和基質(zhì)顆粒度。[結(jié)果]當(dāng)純棉籽殼為主料、石灰添加量為4%、基質(zhì)顆粒度大于1 cm時(shí)，袋料栽培靈芝生物轉(zhuǎn)化率最高；當(dāng)雜木屑用量25%、棉籽殼用量25%、玉米芯用量50%、石灰添加量為1%、基質(zhì)顆粒度大于1 cm時(shí)，多糖含量最高；當(dāng)雜木屑用量50%、棉籽殼用量50%、石灰添加量為2%、基質(zhì)顆粒度小于0.5 cm時(shí)，三萜含量最高。[結(jié)論]栽培基質(zhì)對袋料栽培靈芝品質(zhì)影響較大，可通過主料配方、石灰添加量及基質(zhì)顆粒度控制袋料靈芝產(chǎn)量和品質(zhì)。

關(guān)鍵詞靈芝（GANODERMA）；袋料栽培；主料配方；石灰添加量；基質(zhì)顆粒度

中圖分類號(hào)S567.3+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）04-00981-02

基金項(xiàng)目菌類藥材研究與開發(fā)四川省科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2011JTD0021）；四川省十二五育種攻關(guān)項(xiàng)目“菌類藥材優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的收集及新材料的選育”（2011NZ0098—12—04）；國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系藥用菌栽培崗位建設(shè)項(xiàng)目（農(nóng)科教發(fā)[2007]12號(hào)）；四川省公益性科研院所基本科研項(xiàng)目“袋料靈芝營養(yǎng)代謝-藥效成分時(shí)空關(guān)聯(lián)模式的研究”；四川省十二五育種攻關(guān)項(xiàng)目“菌類藥材優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的收集及新材料的選育”（2011NZ0098—12—04）；四川省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目“食藥用菌現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)鏈關(guān)鍵技術(shù)研究集成與產(chǎn)業(yè)化示范（2012 NZ0003）； 四川省農(nóng)業(yè)微生物平臺(tái)項(xiàng)目。

作者簡介魏?。?982-），男，四川成都人，助理研究員，博士，從事藥用真菌研究。*通訊作者，副研究員，博士，從事藥用真菌研究。

靈芝袋料栽培具有產(chǎn)量高、周期短、原料來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)[1]，已逐步取代椴木栽培成為靈芝人工栽培技術(shù)的研究熱點(diǎn)。但是目前關(guān)于靈芝袋料栽培技術(shù)的研究主要集中在產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀上面[2-3]，針對靈芝內(nèi)在品質(zhì)的栽培技術(shù)研究鮮有報(bào)道。作為傳統(tǒng)的名貴中藥材，靈芝（GANODERMA）在我國有著悠久的藥用歷史，收錄于《中華人民共和國藥典》（2010版），主要的藥效成分為靈芝多糖和三萜，這些成分是評價(jià)靈芝品質(zhì)的主要標(biāo)準(zhǔn)。筆者以提升靈芝品質(zhì)為目標(biāo)，從靈芝栽培基質(zhì)的主料配方、石灰添加量及基質(zhì)顆粒度入手，研究靈芝袋料栽培技術(shù)，旨在為靈芝建立“中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范”（GAP）提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 研究對象。靈芝（Ganoderma lucidum （Leyss.ex Fr.） Karst），由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 主要試劑。雜木屑、棉籽殼、玉米芯、石膏和石灰粉等，均購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；葡萄糖、蒽酮、濃硫酸、香草醛、齊墩果酸、無水乙醇、NaHCO3、冰醋酸和氯仿，均為分析純，市售。

1.2方法

1.2.1 主料配方的優(yōu)化。主料配方優(yōu)化采用混料設(shè)計(jì)法，主料由雜木屑、棉籽殼和玉米芯組成，設(shè)定各主料占所有主料的質(zhì)量百分比為X1，X2和X3，均滿足基本約束條件：0≤X1≤1；0≤X2≤1；0≤X3≤1；X1+X2+ X3=1，主料占配方的90%，則在實(shí)際生產(chǎn)過程中主料的添加量為X1=0.9×X1；X2=0.9×X2；X3=0.9×X3。輔料占10%，由8%麩皮、1%石膏和1%石灰組成。考慮到各主料培養(yǎng)基對觀測指標(biāo)存在協(xié)同交互作用，試驗(yàn)采用單純形重心設(shè)計(jì)，并通過軸點(diǎn)增強(qiáng)設(shè)計(jì)選取試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行混料設(shè)計(jì)，共選取10個(gè)觀察試驗(yàn)點(diǎn)，具體設(shè)計(jì)見表1。

1.2.2 石灰添加量的優(yōu)化?；|(zhì)配方采用15%雜木屑、60%棉籽殼、15%玉米芯、8%麩皮、1%石膏，裝袋前按比例分別添加1%、2%、3%和4%生石灰，以不加石灰栽培為對照（CK）。

1.2.3 基質(zhì)顆粒度的優(yōu)化?；|(zhì)配方采用15%雜木屑、60%棉籽殼、15%玉米芯、9%麥麩、石膏1%和1%石灰，以玉米芯和木屑顆粒直徑為研究對象，設(shè)定處理1為顆粒直徑≤0.5 cm，處理2為0.5 cm≤顆粒直徑≤1 cm，處理3為顆粒直徑≥1 cm。

1.2.4 栽培方法。選用22 cm×42 cm×0.002 5 cm的聚丙烯袋，每個(gè)配方20袋，于121 ℃高壓滅菌2.5 h，冷卻至室溫后接種，在25 ℃、空氣相對濕度70%、避光培養(yǎng)至菌絲長滿袋，菌絲滿袋后移入出菇棚出芝。出菇棚溫度為16～24 ℃，濕度為65%～80%。

1.2.5 指標(biāo)的檢測。（1）靈芝生物轉(zhuǎn)化率。采摘第1潮靈芝子實(shí)體，記錄每袋收獲干芝重量，計(jì)算生物轉(zhuǎn)化率，生物轉(zhuǎn)化率（%）=干芝重量（g）/每袋干重（g）×100。（2）多糖含量測定[4]。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，采用硫酸-蒽酮法測定。（3）三萜含量測定[5]。以齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)，采用香草醛-高氯酸法測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析。混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)根據(jù)結(jié)果建立回歸方程，求觀測指標(biāo)Y與影響因子X的數(shù)學(xué)模型，計(jì)算線性回歸方程，應(yīng)用Minitab 15軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2結(jié)果與分析

2.1主料配方的優(yōu)化 采用軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，并采用逐步法和后退法減少不顯著變量，對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（F檢驗(yàn)）。當(dāng)P<0.01時(shí)，回歸模型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上才有意義。根據(jù)上述條件和結(jié)果，建立生物轉(zhuǎn)化率Y與主料各成分X之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型為：Y=3.69 X1+6.78 X2+4.39 X3，R2=0.799 9，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性基本可以用此回歸模型來解釋。將多糖、三萜與各主料各成分X關(guān)系的數(shù)學(xué)模型經(jīng)過顯著性檢驗(yàn)可知，P>0.01，說明2個(gè)模型的擬合度差，不描述多糖含量和配方之間的關(guān)系，但是通過優(yōu)化結(jié)果可知，配方7的多糖含量最高；配方2的三萜含量最高（表2）。

2.2石灰添加量的優(yōu)化結(jié)果 圖1表明，隨著石灰添加量的增加，袋料栽培靈芝生物轉(zhuǎn)化率有增加的趨勢，在靈芝栽培基質(zhì)中添加4%生石灰時(shí)生物轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到4.3%。當(dāng)石灰添加量為2%的時(shí)候，靈芝三萜含量最高，為0.76 mg/g。當(dāng)石灰添加量低于或高于2%的時(shí)候，三萜含量均略有降低。在添加量為1%～3%時(shí)，靈芝多糖含量隨石灰添加量增加而降低；當(dāng)石灰添加量為1%的時(shí)候多糖含量最高，為3.24 mg/g。

3結(jié)論與討論

研究表明，不同靈芝栽培方式和基質(zhì)對靈芝品質(zhì)具有明顯影響[6-7]。試驗(yàn)通過靈芝栽培基質(zhì)的主料配方、石灰添加量及基質(zhì)顆粒度的研究，以提升品質(zhì)為目標(biāo)對中藥材靈芝袋栽培技術(shù)進(jìn)行初探。通過混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到了靈芝代料栽培主料配方與生物轉(zhuǎn)化率之間回歸方程，在靈芝主料配方的通過回歸方程的系數(shù)可以看出，影響靈芝生化轉(zhuǎn)化率的因素作用大小為棉籽殼>玉米芯>雜木屑，該結(jié)果與蔣冬花的研究結(jié)果基本相同[8]。通過該方程計(jì)算出靈芝生物轉(zhuǎn)化率最高的主料配方為：90%棉籽殼，預(yù)測生物轉(zhuǎn)化率最高為6.78%。雖然試驗(yàn)沒有得到主料配方與靈芝品質(zhì)（多糖含量和三萜含量）的準(zhǔn)確關(guān)系，但是發(fā)現(xiàn)主料配方對靈芝品質(zhì)（多糖含量和三萜含量）具有明顯影響。

多數(shù)食藥用菌對鈣具有富集作用[9-11]。高明俠等報(bào)道鈣離子對靈芝的生長具有促進(jìn)作用[12]，這與試驗(yàn)結(jié)果相似：隨著石灰的添加量增加靈芝的生物轉(zhuǎn)化率提高。在靈芝袋料栽培種添加石灰，除為食用菌的生長補(bǔ)充鈣外，主要作用是調(diào)節(jié)基質(zhì)pH值。研究發(fā)現(xiàn)，液體發(fā)酵靈芝在較低pH值時(shí)有利于多糖和三萜的形成[13-14]，這就解釋試驗(yàn)中靈芝多糖和三萜在石灰添加量較少時(shí)反而更高的現(xiàn)象。

玉米芯和木屑在基質(zhì)中除了起到營養(yǎng)物質(zhì)的作用外，還具有支撐基質(zhì)的作用，有利于氣體和熱量的交換，因此基質(zhì)的顆粒度越大，越有利于菌絲生長。在杏鮑菇栽培基質(zhì)的研究中也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果[15]，隨著大顆粒玉米芯含量的增加，生物學(xué)效率增加。研究發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)靈芝在較高的搖床轉(zhuǎn)速時(shí)，有利于胞外多糖的形成[16]，推測多糖的合成需要充足的氧氣，而靜置培養(yǎng)更利于三萜的形成[17]，推測三萜合成需要低氧環(huán)境，這可以解釋為什么袋料栽培靈芝時(shí)，多糖含量隨基質(zhì)顆粒度增加而增加，但三萜含量卻降低。

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，栽培環(huán)節(jié)對靈芝品質(zhì)影響較大，可通過主料配方、石灰添加量及基質(zhì)顆粒度可控制袋料靈芝產(chǎn)量和品質(zhì)。雖然試驗(yàn)結(jié)果不是很全面，還有很多參數(shù)尚待研究，但是對建立靈芝GAP袋料栽培技術(shù)具有重要的參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] 池小妹.我國靈芝人工栽培技術(shù)研究現(xiàn)狀[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2005，16（8）： 791-792.

[2] 胡景平.黃土高原代料栽培靈芝篩選實(shí)驗(yàn)研究[J].北方園藝，2008（3）：228-229.

[3] 甘雙楊， 桂珍， 劉碧源， 等.袋料栽培靈芝配方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（3）：83-84.

[4] 戚雁飛.靈芝中靈芝多糖的含量測定研究[J].中國中藥雜志，2006，31（10）： 852-853.

[5] 王偉， 尚德靜， 溫磊.靈芝發(fā)酵菌絲三萜類化合物含量的測定[J].中國食用菌，2006，25（1）： 30-32.

[6] 陳璐.不同栽培基質(zhì)和生長期的靈芝藥效品質(zhì)特異性研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008：51-67.

[7] 劉松潔， 鄭林用， 許曉燕， 等.培養(yǎng)基原料和配方對不同生產(chǎn)方式下靈芝品質(zhì)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011，39（6）：3674-3676.

[8] 蔣冬花.培養(yǎng)基配方與栽培方式對靈芝產(chǎn)量和質(zhì)量的影響[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，19（1）： 76-79.

[9] 曾雨雷， 胡家俊， 楊波， 等.液態(tài)發(fā)酵冬蟲夏草菌制備生物活性鈣的研究[J].食品與發(fā)酵科技，2012，48（2）：16-19.

[10] 王偉霞， 李福后， 陳立國.茯苓菌絲體富集鈣的研究[J].食用菌，2007（1）：9-10.

[11] 卜慶梅， 王麗娟， 劉林德， 等.3種食用菌菌絲體富鈣的研究[J].食品科學(xué)， 2009（21）：172-174.

[12] 高明俠， 秦衛(wèi)東， 苗敬芝，等.富鈣靈芝的深層培養(yǎng)[J].生物技術(shù)通訊， 2007， 18（4）：641-643.

[13] 劉冬，李世敏.pH值及溶解氧對靈芝多糖深層液態(tài)發(fā)酵的影響與控制[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001（6）： 7-10.

[14] 凌慶，枝王林，魏兆軍，等.pH值控制靈芝發(fā)酵產(chǎn)生靈芝酸的研究[J].中國釀造，2009（3）： 117-120.

[15] 李正鵬.杏鮑菇培養(yǎng)階段基質(zhì)理化特性變化的研究[D].上海：上海海洋大學(xué)， 2010.

[16] 李平作，徐柔，章克昌.靈芝液體發(fā)酵過程中菌體形態(tài)與胞外多糖產(chǎn)量的關(guān)系[J].工業(yè)微生物，2000，30（3）：20-23.