江梅 宋慶林

【摘 要】目的：探討苦參堿對ＨＬ-60白血病細胞增殖及凋亡的影響。方法：運用ＭＴＴ法和流式細胞術(shù)檢測苦參堿對ＨＬ-60白血病細胞的增殖抑制及促凋亡作用, 應用實時定量PCR技術(shù)檢測Ｂｃｌ-2蛋白的表達。結(jié)果：隨著苦參堿濃度的升高, 各項指標與對照組相比較的差異均有統(tǒng)計學意義(Ｐ<0.01);ＨＬ-60細胞增殖明顯受到抑制;細胞凋亡率明顯增加, 且當苦參堿濃度為2.0mg/ml時, 細胞凋亡率達65.84%;2.0mg/ml苦參堿作用72ｈ后的細胞, ｂｃｌ-2蛋白的表達較對照組顯著減少。結(jié)論：苦參堿具有對ＨＬ60白血病細胞增殖抑制及促凋亡作用, ｂｃｌ-2蛋白表達下調(diào)在此過程中可能發(fā)揮著重要的作用。

【關(guān)鍵詞】苦參堿；ＨＬ-60細胞；ｃｌ-2蛋白

【文章編號】1004-7484（2014）03-01099-01

苦參堿（Mat）是傳統(tǒng)中藥苦參的有效成分，研究報道苦參堿類藥具有顯著抑制腫瘤增殖、誘導腫瘤分化和凋亡、抗腫瘤浸潤和遠處轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤新生血管形成、減輕腫瘤炎癥和抑制腫瘤耐藥性、減低化療不良作用、增強腫瘤宿主免疫等功能［1］。本實驗觀察苦參堿對HL一60細胞增殖與分化方面的影響，并對其作用機制進行初步探討，以期對白血病的治療提供參考。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)苦參煎液對人早幼粒白血病細胞有誘導分化作用[2]；近幾年有人研究了苦參堿對K562細胞誘導分化作用、苦參抗人急性髓系自血病HL一60細胞作用[3~5]本實驗采用苦參堿干預處理人急性早幼粒白血病HL一60細胞，進一步證實其對HL一60細胞的增殖抑制和促進誘導凋亡作用，并觀察苦參堿誘導HL一60細胞凋亡時Bcl一2基因表達變化并探討凋亡發(fā)生的機制。為開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 苦參堿購自百靈威科技，貨號KS-5203，經(jīng)HPLC法鑒定純度＞98%。陽性藥物順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司（國藥準字H20040813）。

1.2 細胞株 人早幼粒細胞白血病細胞株HL-60來自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所基礎(chǔ)醫(yī)學細胞中心。

1.3 試劑 RPMI1640培養(yǎng)液及四甲基偶氮唑藍（MTT）均購自美國GIBCO公司；小牛血清購自杭州四季青生物有限公司；

1.4方法 細胞培養(yǎng)：HL-60細胞為懸浮生長的細胞，用含有10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，37.5℃、5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。每2 d換液傳代，實驗選用對數(shù)生長期細胞。

1.4.1 實驗分組 實驗分為陰性對照組，實驗組（苦參堿低、中、高濃度組：0.5、1、2 mg/ml），順鉑陽性對照組（0.01 mg/ml）。

1.4.2 MTT比色法觀察藥物對細胞生長的影響 取處于對數(shù)生長期HL-60細胞，調(diào)整細胞濃度為2×105 /ml，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。各苦參堿處理組給予相應濃度苦參堿，陽性對照組給予順鉑0.01 mg/ml，對照組給予與最高給藥濃度組等量的藥物溶媒。每個劑量設(shè)6個平行孔，重復3次。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后吸去上清，加入DMSO顯色，避光平行振蕩10 min，在酶標儀上測定波長為490 nm處的吸光度，計算生長抑制率（%）=1－實驗孔OD值/對照組OD值。

1.4.3流式細胞術(shù)檢測苦參堿誘導ＨＬ60細胞的凋亡率以0.5、1.0、2.0mg/mＬ濃度的苦參堿作用72ｈ后分別收集ＨＬ60細胞。按照試劑盒說明操作, ＰＢＳ洗滌2次, 用結(jié)合緩沖液將細胞濃度調(diào)整為1×106/ml，取100ml加5ulAnnexin -V和10ulPI溶液，混勻。室溫避光孵育15分鐘后加入400ul緩沖液，上機檢測。

1.4.4凋亡相關(guān)基因Bcl-2的mRNA表達檢測 根據(jù)NCBI Gene banck中cDNA序列，按照互補原則，兼并Tm值、C+G含量等因素進行引物設(shè)計：

Bcl-2： 上游引物：5'- TGT GTG GAG AGC GTC AAA CC-3'；

下游引物：5'- TGG ATC CAG GTG TGC AGG T-3'；

根據(jù)上述引物，采用北京全式金實時定量RT-PCR試劑盒檢測Bcl-2的 mRNA表達。

2 結(jié)果：

2.1 苦參堿對HL-60細胞生長抑制率的影響

對照組HL-60細胞生長活躍，而各劑量苦參堿處理組HL-60細胞生長相對緩慢。經(jīng)MTT比色法測定得出，0.5 mg/ml組、1 mg/ml組和2 mg/ml組測得的吸光度均較對照組顯著降低（P<0.01），表示苦參堿可顯著抑制HL-60細胞的增殖。不同濃度苦參堿對ＨＬ60白血病細胞增殖有抑制作用, 而且這種作用呈時間-劑量依賴關(guān)系,隨著苦參堿濃度增加或作用時間延長，ＨＬ60白血病細胞增殖抑制率增加, 詳見表1、表2

2.2苦參堿對HL-60細胞凋亡的影響：

ＨＬ60細胞經(jīng)0.5、1.0、2.0mg/ml的苦參堿分別作用24、48、72ｈ后, 用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示:在一定的濃度范圍內(nèi)(0.5～2.0mg/ml)苦參堿誘導ＨＬ60細胞凋亡的作用隨著苦參堿濃度的增加而增強, 具有濃度依賴性;隨著作用的時間延長苦參堿的誘導凋亡作用也增強, 差異有統(tǒng)計學意義(Ｐ<0.01)見表3。結(jié)果提示:一定濃度范圍內(nèi)(0.5～2.0mg/ml)苦參堿誘導細胞凋亡作用呈時間-劑量依賴關(guān)系。

Annexin -V FITC/PI雙染法FCM檢測顯示，不同濃度苦參堿作用48h對HL-60細胞凋亡利率Annexin -V（+）/PI(-）的影響（n=5)見表3。如表3所示，不同濃度苦參堿作用后，細胞凋亡率明顯高于空白對照組（p<0.01)，且隨濃度的增加凋亡率從47.83%增加到65.84%。

為進一步檢測苦參堿促進HL-60細胞凋亡的可能機制，本研究利用實時定量RT-PCR法檢測了凋亡相關(guān)基因Bcl-2的mRNA表達。如表4所示，苦參堿0.5 mg/ml組對Bcl-2基因的表達無顯著影響?？鄥A2.0 mg/ml組對Bcl-2基因具有顯著的抑制作用（P<0.01）。

3 討論：

苦參是我國傳統(tǒng)的常用中醫(yī)藥，苦參堿是其主要的生物堿之一，已能提取和純化，具有抑制腫瘤生長、抗感染等多種功能。白血病是一種常見的腫瘤性疾病，ALL是自血病中常見一種類型，在小兒尤其多見。目前主要采用化療和骨髓移植，費用昂貴，且化療副作用大，開發(fā)中藥治療是治療白血病的一個方向。經(jīng)MTT比色法測定得出，0.5 mg/ml組、1 mg/ml組和2 mg/ml組測得的吸光度均較對照組顯著降低，表示苦參堿可顯著抑制HL-60細胞的增殖。不同濃度苦參堿對ＨＬ60白血病細胞增殖有抑制作用, 而且這種作用呈時間-劑量依賴關(guān)系,隨著苦參堿濃度增加或作用時間延長，ＨＬ60白血病細胞增殖抑制率增加, 見表1、表2。

本結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參堿對ALL細胞的增殖有抑制作用，苦參堿在相對低濃度下(0．5 mg／m1)對ALL細胞有誘導凋亡作用，但相對高濃度時的(2mg／m1)可見細胞抑制率明顯增高。在一定的濃度范圍內(nèi)(0.5～2.0mg/ml)苦參堿誘導ＨＬ60細胞凋亡的作用隨著苦參堿濃度的增加而增強, 具有濃度依賴性;隨著作用的時間延長苦參堿的誘導凋亡作用也增強, 差異有統(tǒng)計學意義(Ｐ<0.01)見表3。結(jié)果提示:一定濃度范圍內(nèi)(0.5～2.0mg/ml)苦參堿誘導細胞凋亡作用呈時間-劑量依賴關(guān)系?，F(xiàn)已證明，細胞凋亡調(diào)控蛋白與白血病發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。近年研究表明Bcl一2參與了細胞誘導、分化、凋亡的調(diào)控，Bcl一2家族成員在內(nèi)源性凋亡途徑(線粒體途徑)中起著重要作用。Bcl一2家族成員包括抑制凋亡的基因和促凋亡基因，本實驗通過RT—PCR檢測發(fā)現(xiàn)，苦參堿在0.5—1.0mg／mL濃范圍內(nèi)，隨著苦參堿濃度的增加，Bcl一2的表達逐漸減少，與苦參堿的濃度呈反比關(guān)系。說明苦參堿誘導細胞凋亡的過程中，抑凋亡基因Bcl一2表達減少，同時也表明Bcl一2基因在苦參堿誘導細胞凋亡中起著一定的調(diào)控作用。

研究發(fā)現(xiàn)一定濃度苦參堿作用ALL細胞可引起生長抑制，具有一定的凋亡誘導作用。利用實時定量RT-PCR法檢測了凋亡相關(guān)基因Bcl-2的mRNA表達。如表4所示，苦參堿0.5 mg/ml組對上述基因的表達無顯著影響。對抑凋亡基因Bcl-2具有顯著的抑制作用（P<0.05或P<0.01）RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)苦參堿作用后的ALL細胞Bd一2陽性率呈明顯的下降趨勢，苦參堿可下調(diào)ALL細胞Bcl．2表達，推測苦參堿對ALL細胞生長抑制作用可能與其下調(diào)ALL細胞Bcl一2基因表達有關(guān)，進一步研究其機制，開發(fā)并把苦參堿應用于臨床將具有重要意義。

已有研究證實，苦參堿對白血病細胞的增殖具有明顯的抑制作用，能促進白血病細胞凋亡，并能誘導白血病細胞從功能上向成熟細胞分化。說明苦參堿具有抗白血病的作用，可能是通過抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡實現(xiàn)的。至于苦參堿對HL-60細胞抑制增殖和誘導分化作用的具體機制還需要我們進一步的探索。

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