李紅

【摘 要】目的：研究基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、血管生長因子（VEGF）、凋亡細(xì)胞調(diào)節(jié)基因（Bcl-2和Bax）在增生期子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥,EMs)患者中的水平表達的相關(guān)性。方法：采用免疫組化法檢測內(nèi)異癥56例異位內(nèi)膜、40例在位內(nèi)膜和48例對照組的增生期子宮內(nèi)膜中MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax的表達。結(jié)果： ①MMP-2表達異位內(nèi)膜組高于在位內(nèi)膜組和正常內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；②VEGF表達異位內(nèi)膜組強于在位組和對照組內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)； ③Bcl-2和Bax蛋白表達各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，但Bcl-2表達在異位內(nèi)膜增生期最強；④MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax各指標(biāo)之間均存在等級相關(guān)性。結(jié)論：MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax可能相互影響，共同參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥；MMP-2；VEGF；Bcl-2；Bax；免疫組織化學(xué)

【中圖分類號】R711 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）03-01107-01

子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥，Endometriosis，EMs )指子宮內(nèi)膜在子宮腔被覆面以外的地方種植生長，包括內(nèi)膜間質(zhì)和上皮細(xì)胞在子宮腔以外部位的異位生長，是生育期婦女的常見病。近年來EMs的發(fā)病率有上升趨勢，其在分子水平上的發(fā)病機理尚不完全清楚?；さ耐暾c否也是影響EMs發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移種植的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MMPs是一組與鋅結(jié)合的主要分解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，與EMs的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。本研究采用免疫組化法對EMs內(nèi)膜中的MMP-2、VEGF 、Bcl-2和Bax水平進行檢測，探討其在EMs相關(guān)性及發(fā)生發(fā)展中的作用，為EMs的臨床診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

所選病例為2011年6月~2012年12月期間就診于萊西市市立醫(yī)院婦產(chǎn)科的子宮內(nèi)膜異位癥患者56例（術(shù)后病理檢查證實為內(nèi)異癥者），年齡28~50(34.3士5.2)歲，同時通過刮宮或切開手術(shù)取其在位子宮內(nèi)膜40例，年齡28~51(35.2士4.3)歲。選擇同期因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)的48例正常子宮內(nèi)膜為對照組，年齡26~48(35.8士3.9)歲，所有內(nèi)膜均為增生期。所有患者無其它內(nèi)外科及內(nèi)分泌疾病，術(shù)前三個月未應(yīng)用激素治療，月經(jīng)周期規(guī)律。所有組織術(shù)后立即取材，經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片5張，1張行常規(guī)HE染色進行病理形態(tài)學(xué)觀察，余者用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2 方法

1.2.1主要試劑：兔抗人VEGF多克隆抗體試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，鼠抗人MMP-2、Bcl-2、Bax單克隆抗體、SP免疫試劑盒和山羊血清、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2.2 SP法檢測：MMP-2、VEGF、Bcl-2、Bax蛋白表達 切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精至水。采用SP法進行免疫組織化學(xué)染色，實驗操作嚴(yán)格按說明書進行。以0.01M PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性標(biāo)本為陽性對照。

1.2.3 免疫組化陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax陽性信號為腺上皮細(xì)胞胞漿呈棕黃色著色，根據(jù)文獻Krajewska[1]，按半定量的方法評定每一張標(biāo)本:隨機選取高倍鏡（×400）下至少5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞的百分率，并進行計分（0~4分），同時對陽性細(xì)胞免疫染色強度進行計分（0~ 3分），免疫組化染色評分=陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評分×染色強度評分。0分為陰性(-)，1~2分為弱陽性(+)，3~4分為中等陽性(++)，4分以上為強陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SSPS11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，秩和檢驗比較各組間免疫組化結(jié)果，Kendalls W等級相關(guān)分析相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)表達情況

MMP-2主要表達于子宮內(nèi)膜組織的腺上皮細(xì)胞胞漿中，間質(zhì)中也有表達。異位內(nèi)膜組與在位內(nèi)膜組和對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在位內(nèi)膜組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2 血管生長因子(VEGF)表達情況

VEGF主要定位于腺上皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中，同時也分散存在于周圍間質(zhì)細(xì)胞中。異位內(nèi)膜表達強于在位和對照組內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.3 凋亡調(diào)節(jié)基因（Bcl-2、Bax）表達情況

Bax主要表達在腺上皮細(xì)胞胞漿，異位內(nèi)膜組表達低于在位內(nèi)膜組和對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。Bcl -2蛋白主要表達于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜上，偶見細(xì)胞核表達，呈黃色或棕黃色。異位內(nèi)膜表達強于在位內(nèi)膜和對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.4各指標(biāo)間相關(guān)關(guān)系

采用Kendalls W等級相關(guān)，分析異位內(nèi)膜組MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)各指標(biāo)間存在等級相關(guān)性，見表2。

3 討論

近年，隨著月經(jīng)初潮的低齡化，分娩的高齡化及少育的現(xiàn)象，EMs成為年輕女性及育齡女性多發(fā)疾患之一，其發(fā)病率也呈上升趨勢。目前一致認(rèn)為侵襲、轉(zhuǎn)移、種植是EMs的主要特征，由多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程。凋亡細(xì)胞調(diào)節(jié)基因Bcl-2與Bax參與了這復(fù)雜過程，而對細(xì)胞外基質(zhì)的降解及血管生成是重要先決條件[3]，因此，對EMs的相關(guān)性研究更具有臨床意義。

3.1 MMP-2在異位癥中的作用

本實驗發(fā)現(xiàn)，MMP-2在異位內(nèi)膜組呈高水平表達，而在位內(nèi)膜組和對照組呈低水平表達，與文獻報道一致[4-6]，提示異位病灶具備較高的蛋白水解能力，由于MMP-2的蛋白水解活性有利于腹腔的侵襲，因此異位內(nèi)膜中MMP-2蛋白的過度表達可使其具有較高的侵襲能力，能夠降解異位內(nèi)膜周圍的基底膜及其它ECM成分，破壞腹膜間質(zhì)細(xì)胞的連接，進而侵襲腹膜及病灶周圍的結(jié)締組織，使異位內(nèi)膜在腹膜內(nèi)種植生長并使病灶不斷擴大，異位內(nèi)膜一旦植入腹膜表面后，腹腔微環(huán)境發(fā)生變化，各種細(xì)胞因子分泌增加，MMP-2的表達進一步增加，侵襲力進一步增強，促進了EMs形成和病情的進展。

3.2 VEGF在在異位癥中的作用

VEGF是參與調(diào)控血管生成的最重要的血管生長因子，對于血管內(nèi)皮細(xì)胞有高特異性的促增殖作用，可直接而特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致新生血管形成。異位內(nèi)膜中VEGF含量增高，在內(nèi)分泌和旁分泌的共同作用下刺激毛細(xì)血管增生，為異位生長的腺上皮細(xì)胞提供賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，促進異位內(nèi)膜增殖和侵襲入腹腔內(nèi)組織。本研究結(jié)果表明，VEGF在異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組和對照組中表達強度依次減弱，提示子宮內(nèi)膜異位癥中血管生成活動增強。

3.3 Bcl-2和Bax在異位癥中的作用

凋亡作為一種生理或病理性的細(xì)胞消亡，普遍存在于生物界，機體通過凋亡消除衰老的細(xì)胞并代之以新的細(xì)胞，從而維持組織器官中細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定。子宮內(nèi)膜的周期性增生與脫落通過細(xì)胞增殖和凋亡形式來實現(xiàn) [7] 。凋亡存在于子宮內(nèi)膜異位癥患者在位、異位內(nèi)膜及腹腔液巨噬細(xì)胞中，凋亡調(diào)節(jié)基因Bcl-2和Bax在EMs的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Bcl-2是一種原癌基因，其重要生物學(xué)功能是延長細(xì)胞壽命并增加細(xì)胞對多種凋亡刺激因素的抗性，被稱為凋亡抑制基因，Bax加速細(xì)胞死亡，被稱為細(xì)胞凋亡促進基因，這兩類蛋白質(zhì)的比值決定細(xì)胞在受到凋亡信號刺激時是否發(fā)生凋亡。Bcl-2/Bax異二聚體的比值在凋亡中起重要作用，其比值越低，凋亡越明顯。

本研究結(jié)果顯示，雖然Bcl-2和Bax蛋白在正常子宮內(nèi)膜、在位和異位子宮內(nèi)膜表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但Bcl-2表達在異位內(nèi)膜增生期最強，而Bax蛋白表達在異位內(nèi)膜最弱，Bcl-2和Bax共同表達于正常子宮內(nèi)膜、在位和異位子宮內(nèi)膜增生期腺上皮，且Bcl-2明顯占優(yōu)勢，說明增生期Bcl-2/Bax比值上升，抑制細(xì)胞凋亡，保證此期內(nèi)膜細(xì)胞進行大量的增生，對子宮內(nèi)膜功能層進行快速的修復(fù)，促進內(nèi)異癥的發(fā)生和發(fā)展。

3.4 MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax之間的相互作用

分析異位內(nèi)膜組MMP-2、VEGF、Bcl-2和Bax的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)各指標(biāo)間存在較強的相關(guān)性，提示細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管生成及細(xì)胞凋亡可能以某種機制共同參與子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶的形成和發(fā)展，進一步證實了子宮內(nèi)膜異位癥是一個多因素疾病，其作用機制目前尚不清楚，有待于進一步研究。

參考文獻

[1] 任云青.子宮內(nèi)膜異位癥與細(xì)胞凋亡[J].醫(yī)學(xué)綜述，2005，11（8）：689-691.

[2] 王紅，吳若松.基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2002，11(4)：261~262.

[3] 黃博，陳茂懷。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進展[J]。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006,19（4）：293-296

[4] 邱曉紅，李荷蓮.基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9及抑制因子TIMP-1 TIMP-2在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達及意義[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2004，20（3）：158~160.

[5] 李鐵臣，孔麗娜，孫青，等. 子宮內(nèi)膜異位癥中MMP-2，MMP-9表達的研究[J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，24（2）：107~108.

[6] Mizumoto,Saito T,Ashihara K et al.Expression of matrix metalloproteinases in ovarian endometrio：immunohistochemical study and enzyme immunoassay,Lite Sci,2002,71(3):259~273.

[7] 王百霞，李亞里.細(xì)胞凋亡與子宮內(nèi)膜異位癥[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2000，25(6):161-163.