滕飛翔 孫金霞 俞黎黎 卞勇華 王運(yùn)剛 王 楠 張承伯 崔玉寶

摘 要：使用多種生物信息學(xué)工具來預(yù)測、比較塵螨變應(yīng)原Der f 9、Der p）9和Blo t 9的一級、二級、三級結(jié)構(gòu)及抗原表位，找出3種蛋白結(jié)構(gòu)及功能的異同Der f 9、Der p 9和Blo t 9氨基酸序列一致性為82.07%，都含有3個(gè)胰蛋白酶活性位點(diǎn)氨基酸及2個(gè)功能結(jié)構(gòu)區(qū)特異性序列；二級和三級結(jié)構(gòu)中都由α一螺旋、β折疊和無規(guī)卷曲組成：活性位點(diǎn)氧基酸在三級結(jié)構(gòu)中完全重合，并相互靠近構(gòu)成蛋白酶的活性中心；主要潛在抗原表位區(qū)域都為5個(gè)，并在第47-49aa和200-203aa區(qū)域出現(xiàn)了重合.但表位重合區(qū)的氨基酸種類不完全相同 ，應(yīng)用生物信息方法預(yù)測和比較了Der f 9、Der p 9和Blo t 9結(jié)構(gòu)與抗原方面的信息.為進(jìn)一步研究變應(yīng)原第9組分的生物學(xué)功能、疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：塵螨：變應(yīng)原；結(jié)構(gòu)；抗原表位

中圖分類號：Q71

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007 7847（2014）06一0483一05

塵螨（house dust mites）廣泛存在于人類生活和工作環(huán)境中，是室內(nèi)變應(yīng)原的重要來源之一，其螨體、螨卵、螨蛻下的皮、死亡螨體的裂解物及活螨的排泄物、分泌物等都可成為變應(yīng)原，可導(dǎo)致多種I型變心性疾病，如變成性哮喘、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性皮炎等。 目前發(fā)現(xiàn)粉塵螨（Der-matophagoides farinae. Der f）、屋塵螨（Dermato -phayoides pteronyssinus， Der p）和梅氏嗜霉螨（Eu-roglyphus maynei，Eur m）是3種世界范圍內(nèi)廣泛分布的室內(nèi)優(yōu)勢致敏螨類。在熱帶和亞熱帶地區(qū).熱帶無爪螨（Blomia tropicalis，Blo t）也是重要的室內(nèi)優(yōu)勢致敏螨種。目前發(fā)現(xiàn)的塵螨變應(yīng)原組分共有24種，其中變應(yīng)原第9組分具有胰蛋白酶活性，屬于胰蛋白酶家族，與IgE結(jié)合率很高.達(dá)到90%。

本文擬通過生物信息學(xué)方法.將同屬胰蛋白酶家族Der f 9、Der p 9和Blo t 9的理化性質(zhì)、一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位等指標(biāo)進(jìn)行比較.找出這3種蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間的異同，為后續(xù)進(jìn)行克隆表達(dá)、生物學(xué)功能及免疫學(xué)特性研究提供依據(jù)，從而為其在變態(tài)應(yīng)性疾病診斷、藥物及疫苗研究中的應(yīng)用研究提供線索。

1 材料與方法

1.1

Der f 9、Der p 9和Blo t 9氨基酸序列的獲取

從國際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)（the international u-nion of immunological societies，IUIS）下屬的變應(yīng)原命名委員會(huì)命名數(shù)據(jù)庫（IUIS allergen nomen-clature sub -committee， nomenclature database）和NCBI中的Protein數(shù)據(jù)庫獲得變應(yīng)原Der f9、Der p9和Blo f 9氨基酸序列，去除信號肽序列后，將成熟肽氨基酸序列以FasLa格式保存進(jìn)行后續(xù)操作。

1.2

Der f 9、Der p 9和Blo t 9的理化性質(zhì)與一級結(jié)構(gòu)分析

使用Expert protein analvsis system （ExPASy）Proteomics toolS所提供的ProtParam軟件分別進(jìn)行氨基酸殘基數(shù)目、組成、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和親/疏水性等理化性質(zhì)的在線分析。使用DNAMAN6.0對3種變應(yīng)原氨基酸序列進(jìn)行比對。使用ExPASv中的PROSITE有預(yù)測功能域特征序列和活性位點(diǎn)。

1.3

Der f 9、Der p 9和Blo t 9的二級結(jié)構(gòu)分析

使用TMHMM服務(wù)器預(yù)測3種蛋白的跨膜區(qū)域。使用Jpred服務(wù)器在線分析3種蛋白的α-螺旋、β-折疊及無規(guī)則卷曲組成情況。

1.4

Der f9、Derp9和Blot9的三級結(jié)構(gòu)同源建模

使用同源建模方法來構(gòu)建3種蛋白的三級模型：將3種蛋白的氨基酸序列分別輸入BLASTP服務(wù)器，選取高一致性（高于30%）、低e-value和Gaps值的蛋白質(zhì)作為3種蛋白的最適合模板，最終確定PDB數(shù)據(jù)庫中登錄號為4D8N、1L2E和1EQ9的蛋白質(zhì)分別作為Derf 9、Der p 9和Blo t 9同源建模的模板。將3種蛋白質(zhì)和模板分別輸入到Modeller 9.12軟件中，進(jìn)行目的蛋白三級模型的構(gòu)建。使用Swiss-PdbViewer對構(gòu)建出來的三級模型進(jìn)行能量最小化處理，并使用Procheck和Verify_3D三級程序（http：//nihserver.mbi.ucla.edu/SAVS/）對蛋白質(zhì)三級模型進(jìn)行評估。使用Chimera l.8軟件展示、重合蛋白質(zhì)的三級模型。

1.5 Der f 9、Der p 9和Blo t 9抗原表位分析

使用IEDB analysis resource .ABCpred 和Bepi-Pred軟件，同時(shí)結(jié)合二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析預(yù)測3個(gè)氨基酸序列的線性B細(xì)胞抗原表位，并將預(yù)測出來的主要表位標(biāo)注到蛋白質(zhì)序列比對結(jié)果及三級模型中。

2 結(jié)果

2.1 Der f 9、Der p 9和Blo t 9蛋白質(zhì)理化性質(zhì)比較分析

螨變應(yīng)原第9組分的生化名稱是膠原溶解絲氨酸蛋白酶，屬于胰蛋白酶蛋白質(zhì)家族：Der 9、Der p 9和Blo t 9的氨基酸殘基總數(shù)都是224；而原子總數(shù)和相對分子質(zhì)量等指標(biāo)，Der f 9和Derp9之間比較接近。Der f 9、Der p 9和Blo t 9的堿性氨基酸數(shù)目分別是13、11和12個(gè)，而三者的酸性氨基酸數(shù)目相差不大，分別為17、17和16個(gè)。等電點(diǎn)（pl）的數(shù)值表明，三者都是堿性蛋白質(zhì)。3種蛋白脂肪指數(shù)都很大，表明脂溶性很強(qiáng)；不穩(wěn)定指數(shù)都低于閾值40，都為穩(wěn)定性蛋白：主要平均疏水特性（GRAVY）低于0，都為親水性蛋白：

2.2 Der f 9、Der p 9和Blo t 9-級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域比較

Der f 9、Der p 9和Blo t 9氨基酸序列一致性為82.07%，都含有3個(gè)活性位點(diǎn)氨基酸，分別為組氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）和絲氨酸/半胱氨酸（Ser/Cys）（表2）。雖然3個(gè)活性位點(diǎn)氨基酸在一級結(jié)構(gòu)上相距甚遠(yuǎn)，但在三級結(jié)構(gòu)中卻相互靠近，構(gòu)成酶的活性中心（圖4）。Der f 9.Der p 9和Blot9在活性位點(diǎn)氨基酸His和Ser/Cvs周圍形成了胰蛋白酶功能結(jié)構(gòu)區(qū)特異性序列，分別是LTAAHC與XXCNGDS（或C）GGPLX（見圖1中第I、Ⅱ區(qū)域）。

2.3

Der f 9、Der p 9和Blo t 9二級結(jié)構(gòu)比較分析

Der f 9、Der p 9和Blo t 9都沒有跨膜區(qū)域，全位于胞外；同時(shí)三者的二級結(jié)構(gòu)都含有α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)（圖2），并且都是無規(guī)卷曲的比例最高，β-折疊的比例其次，α-螺旋所占比例最低（表3）。三者的α -螺旋和β一折疊比例比較的結(jié)果顯示.Der f 9的α-螺旋比例最高，Der p 9的α-螺旋比例最低；Der p 9的β-折疊比例要高于Der f 9和Blo t 9（表3）。

2.4 Der f 9、Der p 9和Blo t 9的三級結(jié)構(gòu)比較分析

將預(yù)測出的Der f 9、Der p 9和Blo t 9蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行評測。Der f 9、Der p 9和Blo t 9蛋門質(zhì)分別有100%、99.5%和98.9%，氨基酸殘基位于Ramachandran plot檢測圖中的合理區(qū)域（圖3），這說明模建結(jié)構(gòu)的氨基酸二而角是非常合理的。verify_3D評分結(jié)果顯示，Der f 9、Der p 9和Blot 9分別有89.78%、92.89%和96.56%，氨基酸殘基三級-1D的相容性分值大于0.2，這表明三個(gè)模型一級序列與三級結(jié)構(gòu)的相容性較好。以上評估結(jié)果均表明，同源模建所得到的Der f 9、Der p9和Blo t 9的二級結(jié)構(gòu)是合理可信的。

Der f 9、Derp 9和Blo t 9 三級結(jié)構(gòu)中，也是無規(guī)卷曲的比例最高，β-折疊的比例其次，α -螺旋所占比例最低（圖4）。三級結(jié)構(gòu)中.Der f 9 、Der p9和Blo t 9的α-螺旋比例分別是12.17%（3個(gè)區(qū)段）、10.27%（3個(gè)區(qū)段）和10.71%（4個(gè)區(qū)段）：β一折疊比例分別是30.80%（12個(gè)區(qū)段）、31.25%（12個(gè)區(qū)段）和28.57%（12個(gè)區(qū)段）。三級結(jié)構(gòu)重合的結(jié)果顯示.三者在α -螺旋和β-折疊處發(fā)生了程度較高的重合：在部分無規(guī)卷曲區(qū)域，三者重合程度稍差：三者的活性位點(diǎn)氨基酸則完全重合，并相互靠近構(gòu)成酶活性中心（圖41。

2.5

Der f 9、Der p 9和Blo t 9的B細(xì)胞抗原表位比較分析

抗原表位預(yù)測結(jié)果顯示，Der f 9、Der p 9和Blo t 9氨基酸序列中都有5個(gè)主要潛在抗原表位（表4），都位于蛋白質(zhì)的無規(guī)卷曲區(qū)域（圖4）。另外三者的抗原表位在兩個(gè)區(qū)域（圖1的A和B區(qū)域）出現(xiàn)了重合.但氨基酸種類并不完全一致。A區(qū)域（第47-49位氨基酸）中，Der f 9的抗原表位為EAS. Der p 9抗原表位為EAT，Blo t 9抗原表位為ENN；B區(qū)域（第200-203位氨基酸）中，Der f 9的抗原表位為CLSN. Der p 9抗原表位為CLST，Blo t 9抗原表位為CLHA。

3 討論

目前常用于治療變應(yīng)性哮喘、鼻炎等I類變態(tài)反應(yīng)性疾病的藥物，一般與發(fā)病機(jī)制中的組胺、肥大細(xì)胞和Ig E抗體3個(gè)環(huán)節(jié)相關(guān)，但治療效果都不太理想，且副作用也較大。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，特異性免疫療法（speCific immunotherapy，SIT）逐漸被用來治療I型變反應(yīng)性疾病，此療法具有療效持久、阻滯癥狀的惡化和防止對新變應(yīng)原產(chǎn)生過敏等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是I類變應(yīng)性疾病唯一病因療法。

螨類變應(yīng)原是引起I型變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要變應(yīng)原之一，此類疾病SIT療法常用的變應(yīng)性疫苗是塵螨粗提浸液，但該浸液存在變應(yīng)原、非過敏性或毒性蛋白及其他成分，容易產(chǎn)生副反應(yīng)，并且很難進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，無法明確患者對變應(yīng)原各組分的反應(yīng)程度。近年來，使用基因重組變應(yīng)原方法診斷和治療I型變態(tài)反應(yīng)性疾病逐漸成為主流。在基因重組螨變應(yīng)原表達(dá)過程中，呵減弱其與Ig E抗體的結(jié)合能力，保留其與T細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，因而具有較好的免疫原性，減少免疫治療的危險(xiǎn)性，提高脫敏治療的效果，可替代傳統(tǒng)的天然變應(yīng)原浸液。

Der f 9、Der p 9和Blo t 9都屬于胰蛋白酶家族成員，氨基酸序列一致性為82.07%。三者既是堿性蛋白質(zhì)，又是脂溶性、穩(wěn)定性都很強(qiáng)的親水性蛋白，都含有3個(gè)活性位點(diǎn)氨基酸，分別是His、Asp和Ser/Cvs、His、Asp和Ser/Cvs都是構(gòu)成蛋白酶活性中心的常見氨基酸種類，盡管3種蛋白的His、Asp和Ser/CVs氨基酸在一級結(jié)構(gòu)上相距甚遠(yuǎn)，但在它們在三級結(jié)構(gòu)中卻完美重合在一起，前相互靠近，從而構(gòu)成酶的活性中心（圖4D）。此外，3種蛋白都His和Ser/Cys周圍形成了胰蛋白酶功能結(jié)構(gòu)區(qū)特異性序列，即LTAHC與XXCNGDS（或C）GGPLX。

Der f 9、Der p 9和Blo t 9二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)都含有α一螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲 3種結(jié)構(gòu)，并且都是無規(guī)卷}的比例最高，α-螺旋所占比例最低蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)足預(yù)測抗原表位的重要信息，α-螺旋、β-折疊等結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵鍵能比較高，不易形成抗原表位序列，而無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)則常突出在蛋白的表而，從而構(gòu)成蛋白質(zhì)的功能區(qū)，該區(qū)域內(nèi)常含有B細(xì)胞的優(yōu)勢抗原表位。Der f 9、Der p 9和Blo t 9主要潛在抗原表位都為5種，全部位于蛋白質(zhì)的尤規(guī)卷曲區(qū)域；另外三者的表位出現(xiàn)了2個(gè)重合區(qū)域，但重合的氨基酸種類并不完全相同。

本研究初步找出了Der f 9、Der p 9和Blo t 9結(jié)構(gòu)與功能之間的異同，為本課題后續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)和篩選抗原表位，進(jìn)而研制塵螨變應(yīng)原第9組分的診治疫苗和藥物奠定了基礎(chǔ)。另外本研究還找出了塵螨變應(yīng)原笫9組分的活性位點(diǎn)氨基酸和特異性胰蛋白酶功能域，為以后尋找和歸類新變應(yīng)原提供了一定的理論基礎(chǔ)。