趙大華 孫慧慧 于同英 李友勇

摘 要：atp1基因在植物中是線粒體基因組編碼，其產(chǎn)物ATPl是線粒體ATP合酶F1的α亞基，在小麥BNS的雄性不育系和它的轉(zhuǎn)換系中差異表達(dá)。為了檢測(cè)該基因的表達(dá)豐度，探討與BNS不育性的聯(lián)系，以BNS不育系和它的轉(zhuǎn)換系的幼穗、花藥和穗軸等組織為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，測(cè)定和比較該基因在不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，該基因在各組織中的總表達(dá)量比內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)量高3—4個(gè)數(shù)量級(jí)；在幼穗及各穗軸營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)量一致；花藥與營(yíng)養(yǎng)組織比較，在不育系四分體和單核期花藥中表達(dá)均上調(diào)：在不育系中，該基因表達(dá)量在單核期花藥中顯著下調(diào)。 這些結(jié)果說(shuō)明.線粒體atp1基因在小麥中是一個(gè)高水平表達(dá)基因.在BNS營(yíng)養(yǎng)組織中組成型表達(dá)，在花藥中特異性上調(diào)表達(dá)，在不育系中表達(dá)受到抑制，表現(xiàn)顯著下調(diào).表明atpl基因的下調(diào)表達(dá)與BNS不育性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：小麥：BNS雄性不育；atp1；基因差異表達(dá)分析；熒光實(shí)時(shí)定量PCR

圖分類號(hào)：Q785

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）06-0488-06

ATP合酶（ATP synthase）是高等植物細(xì)胞內(nèi)最人的酶系之一，定位在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、葉綠體、線粒體等細(xì)胞器的內(nèi)膜上。ATP合酶由兩部分組成，即F0和F1，當(dāng)F0和F1在結(jié)合狀態(tài)時(shí)表現(xiàn)ATP合成酶的活性，在分離狀態(tài)下是ATP水解酶活性。線粒體ATP合酶的FI有9個(gè)亞基，F(xiàn)o的亞基數(shù)不同物種數(shù)量不同。線粒體F1中的α亞基有3個(gè)分子，與β亞基3個(gè)分子交替排列，旋轉(zhuǎn)時(shí)合成ATP。研究已經(jīng)明確，線粒體F1α亞基基因atp1位于線粒體基因組上，產(chǎn)物是α亞基蛋白ATPl，其表達(dá)是組成型的，但也受核基因調(diào)控。

植物雄性不育是植物的雌蕊發(fā)育止常，雄蕊發(fā)育不正常，不產(chǎn)生有功能花粉的一種現(xiàn)象。具有該特性的不育系是作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的核心材料。對(duì)不育機(jī)制進(jìn)行研究，多數(shù)結(jié)果都顯示，不育系中與能量供應(yīng)的相關(guān)代謝途徑和組成成分出現(xiàn)異常，表現(xiàn)ATP/ADP比率減少、ATP合酶活性降低、不育和可育植株之間ATPI差異表達(dá)、以及atpl基因差異表達(dá)等。

BNS （Bai-nong slerility，BNS）是一種新發(fā)現(xiàn)的對(duì)溫度敏感的小麥雄性不育系，有良好的不育性和轉(zhuǎn)換性，在雜交小麥利用中有重要價(jià)值。在前期的BNS蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)該不育系和轉(zhuǎn)換后的可育系的四分體到二核期花藥中，線粒體ATP合酶α亞基蛋白ATP1差異表達(dá)，在不育系中表達(dá)下調(diào)，并認(rèn)為ATP1的數(shù)量下調(diào)，將導(dǎo)致ATP合酶組裝量減少，結(jié)果會(huì)使ATP合酶總體活性下降、ATP產(chǎn)量降低，能量供應(yīng)不足。細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平和它的產(chǎn)物蛋白質(zhì)的表達(dá)水平并不都是一致的，但atp1基因在BNS的花藥和組縱中的表達(dá)水平尚未被檢測(cè)。為了進(jìn)一步探時(shí)該基因在BNS中的表達(dá)特性，本文以BNS的花藥以及幼穗和穗軸等組織為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Real time quafititative PCR，qRT-PCR）方法，檢測(cè)和比較該基因在不育系以及它的轉(zhuǎn)換后的可育系小孢子形成前后，也是BNS敗育的關(guān)鍵時(shí)期，在這些組織中的表達(dá)水平，揭示atpl基兇對(duì)BNS雄性不育發(fā)生的影響和作用。

1 材料與方法

1.1 BNS的種植和取材

BNS是本實(shí)驗(yàn)室培育并套袋自交保存的材料，在河南輝縣小麥實(shí)驗(yàn)基地種植，自 10 月 1日到11月18口，每8d播種l期，共播7期。 1）不育系取材：參考蘇晴等的方法，在不育播期（10月1日和10月9 日）的材料進(jìn)入雌雄蕊分化期后取幼穗材料；到四分體期和單核期后，每天上午7時(shí)左右從田間取穗，實(shí)驗(yàn)室顯微鏡檢查花粉發(fā)育時(shí)期正確，在15 ℃以下室溫環(huán)境，冰塊上剝?nèi)≈猩喜啃∷氲谝缓偷诙』ǖ?枚花藥，并及時(shí)收??；同時(shí)取無(wú)小穗的穗軸為營(yíng)養(yǎng)組織材料；2）轉(zhuǎn)換系和轉(zhuǎn)換后的可育系取材：10 月 l7 日播種的材料花粉發(fā)育開(kāi)始轉(zhuǎn)換，可育花粉比例逐漸上升。轉(zhuǎn)換系取10 月 25 日播種的材料，可育系取11月18日播種的材料，取材的小孢子發(fā)育時(shí)期與不育系相同；3）F1的取材：F1組合為BNA×中國(guó)春，10月8日播種，是BNS的不育期，中國(guó)春可恢復(fù)BNS的育性，因此F1是可育的。

取下的幼穗、花藥、穗軸即時(shí)在液氮中冷凍1～2 min，取出放入-80℃冰箱巾保存。共取l0個(gè)樣品，10個(gè)樣品的編號(hào)為wh-l～wh-10，對(duì)應(yīng)的發(fā)育時(shí)期分別為：不育系藥隔期幼穗、不育系叫分體花藥、不育系四分體穗軸、不育系單核期化藥、F1四分體期花藥、F1四分體期穗軸、轉(zhuǎn)換系單核期花藥、轉(zhuǎn)換系單核期穗軸、可育系單核期花約和可育系單核期穗軸。

1.2 qRT-PCR方法

1.2.1 引物

用蘇晴在BNS花藥中檢測(cè)設(shè)汁的引物，序列為：primer F 3'-TTCCGCGATAATGGAATG-CACGCA-5'；Drirner R 3'-_AGCTACCTGCACCT-GTCTGGTCCC -5'，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用試劑主要有RNA提取試劑盒（In-vitrogen，USA）、Promega公司（北京）的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)、中國(guó)大連定顯PCR酶TaKaRa TaqTMHot Start Version（日本Takara公司）、Roche公司（瑞士）的Green I Master。實(shí)驗(yàn)所用主要儀器有：羅氏480熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀、2720 thermal cycler（ABI，USA） PCR擴(kuò)增儀、和Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer （Nan（Jdrop technologies， USA）檢測(cè)儀等。

1.2.3 總RNA提取

材料總RNA提取采用Trizol方法，見(jiàn)蘇睛，50 mg樣品液氮研磨至粉末，1 mL Trizol總RNA抽提液提取.預(yù)冷的75%乙醇洗滌RNA，真空冷凍干燥。干燥的RNA提取物溶于20～40 μL DEPC水，取1.5μL紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和A260/A280的比值：根據(jù)濃度取0.5μg RNA用1%瓊脂糖做純度檢測(cè)，條件是：0.5xTBE，4 V/cm，45 min。

1.2.4 cDNA第一鏈合成

根據(jù)Promega公司的操作說(shuō)明書，1μL OligodT （0.5 μg/μL）和2.0 μg Total RNA加入PCR管，補(bǔ)充DFPC-H20至9μL?；靹蚝箅x心，70℃溫浴10 min，在0 ℃冰浴中與模板退火。之后，用5xRT buffer 4μL、10 mmol/L dNTPs 2μL、RNasin0.5 μL、AMV-Rtase lμL、DEPC H20 3.5 μL，混勻后42 ℃水浴2min，再加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL， 42℃孵育l h完成RT，70 ℃處理10 min使RT酶失活，得到的RT反應(yīng)產(chǎn)物cDNA，可立即用于PCR，或保存在-80 ℃下備用。

1.2.5 目標(biāo)基因熒光定量

使用熒光標(biāo)記PCR方法，熒光染料為SYBRCreen I，羅氏480熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀，3次重復(fù)，采用20 μL反應(yīng)體系：模板1μL，上下游引物各0.5μL， Q-PCR Enhancer 5μL，2xSYBRSYBR Green I 10 μL， DEPC-H20 3μL。PCR反應(yīng)程序采用二步法：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)，每次在延伸階段讀取吸光值；在PCR反應(yīng)完成后做熔解曲線分析，方法是在95℃變性l min，冷卻至65 ℃，然后從65℃到95℃，每秒增加0.1℃，同時(shí)讀取吸光值。

1.2.6 計(jì)算方法

qRT-PCR結(jié)果的比較有不同層次，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理參考Jiang等的計(jì)算方法，在△Ct和AACt水平比較，△△Ct≥l，相對(duì)豐度的倍數(shù)2-△△Ct≥2，即達(dá)差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品RNA質(zhì)量檢測(cè)

Trizol方法提取的花藥總RNA，50 mg樣品提取后定溶到30 μL體積，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖l：OD260/OD20比值檢測(cè)結(jié)果，穗軸組織為1.79～1.84，花藥組織為1.83—1.94。兩項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均顯示RNA質(zhì)量符合要求。

2.2 實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增結(jié)果

熒光染料標(biāo)記的PCR方法，預(yù)試的擴(kuò)增曲線和溶解曲線見(jiàn)圖2，顯示擴(kuò)增的3個(gè)階段典型，擴(kuò)增產(chǎn)物單一。內(nèi)參基因?yàn)楦视腿?3-磷酸脫氫酶（GAPDH， glyceraldehyde -3 -phosphate dehydroge-nase）基因，獲得的樣品ACt、內(nèi)參△Ct見(jiàn)表l，各樣品間△△Ct見(jiàn)表2，部分樣品間AACt的比較見(jiàn)圖3。

2.3 不同組織間的表達(dá)量比較

從表1、2和圖2可看出，atp1基因是一個(gè)高表達(dá)水平基因，相對(duì)表達(dá)量比內(nèi)參基因甘油醛一3-磷酸脫氫酶高4個(gè)以上△Ct數(shù)量級(jí)，在BNS的10個(gè)組織中的表達(dá)模式有如下特點(diǎn)：1）該基因在不育系、可育系和F1的4個(gè)穗軸組織中，即，不育系四分體穗軸、F1四分體期穗軸、轉(zhuǎn)換系單核期穗軸和可育系單核期穗軸，它們的△Ct值相近，分別是-6.613、-6.147、-6.973和-6.177，相互之間的△△Ct值均小于l（見(jiàn)表2），說(shuō)明該基因在營(yíng)養(yǎng)組織中組成型表達(dá)；2）該基因在4組花藥組織和穗軸組織中的表達(dá)，均顯示花藥中表達(dá)水平高于穗軸組織，見(jiàn)圖3A，其中3組（wh-5/wh-6、wh-7/wh -8、wh -9/wh -10） △△Ct值大于l，分別為一1.593、-1.831、-2.047，差異達(dá)顯著水平，wh -2/wh一3為-0.923，接近1，表說(shuō)明atp1基因在花藥中特異性上調(diào)表達(dá)；3）該基因在4個(gè)花藥組織之間的表達(dá)水平比較，顯示不育四分體期花藥中與藥隔期穗組織中表達(dá)一致，仍在較高水平，但到單核期，不育系花藥中表達(dá)下調(diào)，而在轉(zhuǎn)換系和可育系的花藥中，基因表達(dá)保持較高水平（圖3B），單核期的下調(diào)數(shù)量，與不育系四分體期、轉(zhuǎn)換系單核期和可育系單核期的表達(dá)量之間的△△Ct值絕對(duì)值均大于l，達(dá)顯著水平（見(jiàn)表2），表明該基因在不育系單核期的下調(diào)表達(dá)與BNS的不育性相關(guān)：4）樣品Wh-l是不育期BNS減數(shù)分裂前的幼穗組織，該樣品的基因表達(dá)量與5個(gè)花藥樣品表達(dá)量結(jié)果比較，4個(gè)不顯著，但與4個(gè)穗軸的ACt比較.3個(gè)顯著.說(shuō)明藥隔期幼穗的基因表達(dá)特性與花藥接近。幼穗組織雖屬營(yíng)養(yǎng)組織，但它是穗營(yíng)養(yǎng)組織、花藥營(yíng)養(yǎng)組織、孢母細(xì)胞生殖組織等的混合體，已經(jīng)觀察到BNS在該時(shí)期對(duì)溫度敏感，說(shuō)明atp1基因在雌雄蕊分化時(shí)期時(shí)已開(kāi)始差異表達(dá)。

從這些結(jié)果可以看出，atp1基因在BNS不育系、轉(zhuǎn)換后的可育系，以及與中國(guó)春雜交的F1的穗各組織中總體上是組成型表達(dá)；在不育播期條件下，分化的幼穗組織，包括四分體期的花藥，表達(dá)量處在較高水平，但到單核期表達(dá)量顯著下調(diào)；在轉(zhuǎn)換播期和可育播期的條件下，這些組織的該基因表達(dá)量保持在較高水平。

3 討論

植物雄性不育體系是雜種優(yōu)勢(shì)利用的關(guān)鍵技術(shù).探討其不育機(jī)制，對(duì)認(rèn)識(shí)不育的特征特性和創(chuàng)造多遺傳背景不育類型等有重要指導(dǎo)作用。對(duì)水稻、煙草、油菜等作物雄性不育的研究，曾發(fā)現(xiàn)花藥能量供應(yīng)短缺，ATP合酶α亞基蛋白及它的基因差異表達(dá)，因此認(rèn)為atpl是一個(gè)重要雄性不育相關(guān)基因，本文檢測(cè)到該基因在BNS不育系小孢子單核期表達(dá)量顯著下調(diào)，說(shuō)明該基因的表達(dá)與小麥的雄性不育性存在聯(lián)系。

3.1 atpl在BNS可育系穗組織中組成型表達(dá)，花藥中上調(diào)表達(dá)，不育系花藥中顯著下調(diào)

atp1基因在植物雄性不育中的表達(dá)模式，過(guò)去的研究有不同結(jié)果。Bergman在煙草中檢測(cè)atpl基因位于雄性不育基因orf274下游，并共轉(zhuǎn)錄，對(duì)ATP的合成影響顯著，但基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平?jīng)]有檢測(cè)出差異；黃思齊在紅麻中檢測(cè)到atp1基因序列在不育系和保持系中完全相同，但在不育系的葉片和花藥中表達(dá)量下降；Wenliang等檢測(cè)了油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育中10個(gè)線粒體基因表達(dá)譜.除atp6差異表達(dá)外，其他9個(gè)，包括atpl，表達(dá)差異不顯著，宋國(guó)琦等在小麥YS雄性不育A3017中利用cDNA-AFLP方法分離出atpl基因?？梢钥闯?，這些研究結(jié)果中，一些顯示atp1基因的表達(dá)是組成型的，一些結(jié)果是差異表達(dá)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示atp1基因在小麥BNS各營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)量一致，符合組成型表達(dá)的基本模式，但在可育花藥中表達(dá)量比在穗軸等組織中表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明該基因表達(dá)在花藥中具有上調(diào)表達(dá)特異性。在不育系單核期榆測(cè)到表達(dá)量顯著下調(diào)，說(shuō)明BNS的不育性與atp1基因的缺陷表達(dá)存在聯(lián)系，這種缺陷表達(dá)，基因表達(dá)下調(diào)模式與蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)的蛋白質(zhì)下調(diào)表達(dá)模式結(jié)果一致。

3.2

atpl是BNS的重要不育相關(guān)基因

BNS是一個(gè)對(duì)溫度敏感的雄性不育系，當(dāng)花藥發(fā)育過(guò)程中氣溫升高，花粉育性可白行恢復(fù)，這說(shuō)明BNS花粉發(fā)育的一些重要功能基囚，包括atp1基因，其基因本質(zhì)沒(méi)有改變，改變的是在不同的發(fā)育條件下，一些基因功能發(fā)生改變，發(fā)育條件恢復(fù)，基因功能恢復(fù)。因此atpl基因不是不育基因，而應(yīng)是不育基因調(diào)控下的一個(gè)重要相關(guān)基因。推測(cè)該基因，或該基因的產(chǎn)物，是上游不育基因及產(chǎn)物的重要受體，以一種尚未知的方式影響著花粉的發(fā)育。雖然這個(gè)影響過(guò)程未知，但其結(jié)果是易被理解的，ATP在生物體中的重要地位，足以影響到花粉代謝的全部過(guò)程。因此，atp1的差異表達(dá)，以及前期研究的ATP1蛋白的缺陷表達(dá)，可直接導(dǎo)致ATP合成酶的組裝，ATP合成酶數(shù)量減少，將直接導(dǎo)致能量生成減少和供應(yīng)短缺，導(dǎo)致花粉發(fā)育敗育。

3.3 atp1基因在單核期表達(dá)下調(diào)有發(fā)育生物學(xué)依據(jù)

檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)atpl基因在不育四分體期花藥中表達(dá)量仍較高，到單核期花藥表達(dá)下調(diào)，該結(jié)果有花粉發(fā)育進(jìn)程原因。atp1基因是線粒體基因組編碼，線粒體基因組基因表達(dá)受線粒體本身和核基因共同調(diào)控。小孢子是一個(gè)配子體世代，花粉內(nèi)核基因和質(zhì)基因表達(dá)是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程應(yīng)從小孢子游離后，即單核期開(kāi)始。因此，四分體后，小孢子開(kāi)始獨(dú)立發(fā)育，花粉發(fā)育基因表達(dá)程序性啟動(dòng)。不育核基因?qū)|(zhì)基因的調(diào)控一般是抑制性的，因此atp1基因表達(dá)受到核不育基因抑制而下調(diào)。該結(jié)果對(duì)進(jìn)一步探討不育基因?qū)Π谢蜃饔糜兄匾饬x。