郝小花 田連福 楊 校 譚 虹 張志光 李東屏

摘 要：采用石蠟切片、壓片等方法對灰花紋鵝膏菌（Amanita fuliginea）子實體發(fā)育過程進行了觀察，并用核熒光染料Hoechst 33258對灰花紋鵝膏菌子實體發(fā)育過程中的核相變化進行了觀察。結(jié)果表明，灰花紋鵝膏菌子實體發(fā)育是典型的半被果型發(fā)育，菌褶是子實層同時發(fā)育類型，屬于同型菌髓。在于實體發(fā)育過程，單倍的二核擔子核配后形成短暫的二倍體單核擔子，經(jīng)過減數(shù)分裂形成四核擔子，有近40%的擔子中核再進行一次有絲分裂形成8核擔子，擔子進一步發(fā)育產(chǎn)生擔孢子，其中，二核擔孢子約占95%，單核擔孢子約2.4%，三核孢子2%左右，4核擔孢子約0.4%?；一y鵝膏菌基因組中染色體數(shù)目2n=10條。

關(guān)鍵詞：灰花紋鵝膏菌；子實體；核相：染色體

中圖分類號：Q942.4

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）06-05ll-05

灰花紋鵝膏菌（Amanita fuliginea Hongo）是一種劇毒蘑菇，近年來在我國南方地區(qū)發(fā)生了數(shù)十起誤食該菌引起的中毒事件，中毒人數(shù)352人，其中死亡 79。其所含的鵝膏肽類毒素是致死毒素，同時該毒素足生命科學研究中重要的試劑，在抗腫瘤等牛物醫(yī)學領域也有潛在的用途。我們在對其所產(chǎn)牛的毒素、毒理及中毒治療等進行研究的同時，亦在生理生態(tài)、細胞發(fā)育等進行研究。鵝膏菌類真菌，由于不能人工栽培，取材困難，因此，其發(fā)育過程的研究極少有報道。而且，灰花紋鵝膏菌像大多數(shù)其他擔子菌一樣，染色體很小，難于用一般的染色方法進行核相和染色體數(shù)日觀察。以往一股采用繁瑣的蘇木精或吉姆薩染色法，重現(xiàn)性較差，且研究的種類也主要見于易于培養(yǎng)和取材的擔子菌，如草菇、平茹、香菇、鬼傘等。本文采用石蠟切片和熒光染色方法，對灰花紋鵝膏菌子實體發(fā)育及擔子減數(shù)分裂過程中核相變化進行觀察，該研究為進一步閘明灰花紋鵝膏菌的發(fā)育機制，進而為實現(xiàn)灰花紋鵝膏菌的人工栽培提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

灰花紋鵝膏菌（Amanita fuliginea）菌絲體、不同發(fā)育階段的子實體采集于湖南省長沙縣?？ㄖZ氏固定液、熒光染料Hoechst 33258 （Bisbenzimide，Sigma，美國）、磷酸緩沖液（pH 6.8）。

1.2 方法

子實體的發(fā)育觀察采用石臘制片方法，橫切或縱切.切片厚度5μm。

擔子核相觀察采用熒光染色法。將子實體少許置載玻片上，用攝子搗碎，滴一滴染液，混勻，蓋好蓋玻片，靜置10 min，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰花紋鵝膏茵子實體的發(fā)育觀察

土壤中灰花紋鵝膏菌的營養(yǎng)菌絲發(fā)育到一定階段后，某些部位的菌絲會產(chǎn)生分化，向心生成直徑0.5 mm左右的白色菌球，結(jié)構(gòu)上較疏松，由直徑3～4 μm的菌絲體扭結(jié)而成，內(nèi)外菌絲形態(tài)上無甚變化（圖1A、C、F），但菌球中心點細胞是分裂活性中心。繼續(xù)發(fā)育至直徑lmm左右的菌球時，內(nèi)外層菌絲體形態(tài)上開始出現(xiàn)分化。在菌球中心處產(chǎn)生結(jié)構(gòu)致密的球狀原基。該群細胞較細短，因相互擠壓而使菌絲細胞變得有些彎曲，其內(nèi)原生質(zhì)濃，核熒光顯色顯示細胞核分裂旺盛（圖ID、G）。外層的菌絲細胞略粗，排列較疏松，核相清晰，菌絲問夾雜少量膨大的菌絲細胞球，組成原始外菌幕（圖1D）。隨著球狀原基內(nèi)層細胞不斷分裂增多，其外圍細胞也不斷生長膨大，形成另一層由球形細胞和菌絲細胞組成的中層，愈是向外.其球形細胞的比例愈高，體積愈大，最后發(fā)育成外菌幕（圖1E），原始外菌幕在菌體發(fā)育中被撕毀。而球狀原基內(nèi)層細胞的不等分裂，逐步發(fā)育分化出蓋原基和柄原基（圖1E、H）。蓋原基進一步發(fā)育出現(xiàn)菌肉原基，子實層體原基和蓋表皮原基以及內(nèi)菌幕，隨后在子實層體原基中開始形成子實層，子實層出現(xiàn)前無菌褶腔形成，子實層體原基長出側(cè)生菌絲，幾次近端分叉，末端細胞即為原擔子，大量原擔子緊密而規(guī)則地排成層即構(gòu)成子實層（圖1J～K）。子實層是同時發(fā)育類型。其褶緣囊狀體是假囊狀體，是與子實層原基同一來源的菌髓末端細胞膨大，液泡化的結(jié)果。子實層上無側(cè)緣囊狀體。隨著子實層的發(fā)育及菌蓋的膨大，菌柄也逐漸加粗伸長。在菌蓋展開菌柄伸長中，外菌幕被撕開殘留于菌柄基部一起構(gòu)成菌托，內(nèi)菌幕發(fā)育成菌環(huán)（圖1B），菌環(huán)由兩種排列方向的菌絲細胞組成，靠菌褶的一層菌絲體來源于褶緣不育菌絲，靠近菌柄的一層菌絲體來源于內(nèi)菌幕。

2.2 子實體發(fā)育過程中核相變化及染色體數(shù)目觀察

灰花紋鵝膏子實體發(fā)育過程中，只有擔子發(fā)生減數(shù)分裂，像大多數(shù)擔子菌一樣，由二核擔子（圖2A）的兩個單倍性的核發(fā)生核配，融合為一個二倍性核的單核擔子（圖1B），緊接著發(fā)生減數(shù)分裂變?yōu)閱伪缎缘乃暮藫樱▓D2C）。約有40%的擔子為8核（圖2D～EI），是四核擔子再進行一次有絲分裂所致。但也有少量5核～7核擔子；擔子發(fā)育的過程中，會在頂端產(chǎn)生4個擔孢子，擔子中的核會遷移到擔孢子中。95%以上的扭孢子為二核（圖2F），少數(shù)擔孢子為單核和三核孢子（圖2G～H），偶見四核擔孢子（圖2I）（表1）。二核單孢子產(chǎn)生一方面是8核擔子中8核進入4個擔孢子.每個擔孢子二核；另一方面是因為4個單核孢子產(chǎn)生后，在小梗上各進行了一次有絲分裂所致。而單核、三核和四核擔孢子，是由于8核擔子在進入擔孢子中的少數(shù)出錯行為。

擔子在減數(shù)分裂過程中染色體排列呈現(xiàn)典型“土星環(huán)”結(jié)構(gòu)（圖2K—N）。圖2J為減數(shù)第一次分裂的粗線期前后；圖2K為單土星環(huán)的結(jié)構(gòu)；圖2L示減數(shù)分裂中后期兩組姊妹染色單體成環(huán)狀呈一定角度分離；圖M示減數(shù)分裂后期分開的兩組染色單體在擔子中呈雙環(huán)結(jié)構(gòu)；圖2N、Nl示擔子減數(shù)分裂至終變期，兩組二價染色單體，n=5。因此，灰花紋鵝膏基因組中二倍體染色體數(shù)目為10條。

擔子減數(shù)分裂發(fā)生頻率與其發(fā)育階段有密切聯(lián)系。由表2可以看出，菌球期的擔子主要為核配前擔子（88.2%），剩下11.8%為已發(fā)生核配的擔子；發(fā)育到伸長期菌球破裂階段，則大部分擔子停留在核配期（53.9%），少部分已到減數(shù)分裂期（6.5%）；而到伸長期菌球半開階段，各種類型的擔子都可以觀察到，其中57%的擔子處在減數(shù)分裂期，便于進行分裂相和染色體數(shù)目觀察。至菌蓋平展的成熟期，部分擔子已產(chǎn)生擔孢子，核已遷移到擔孢子中。在菌蓋邊卜卷成熟期，絕大部分的擔子都已發(fā)生擔孢子。因此，要觀察灰花紋鵝膏菌擔子的核相和核分裂相，選擇菌球半開的伸長期的子實體為材料比較適宜。

3 討論

擔子菌個體發(fā)育的形式十分多樣，正確認識其子實體生長發(fā)育形成過程，對于分種及屬內(nèi)系統(tǒng)分類有重要意義。鵝膏菌屬真菌的開裂子實層發(fā)育方式（schizohymenium）在傘菌目中是獨一無二的，其子實層及子實體的具體發(fā)育過程至今尚無確切的結(jié)果。Corner （1994）認為本屬真菌子實層體的形成方式與其他傘菌相同，即菌褶的形成是通過離心隆起（centrifugae ridges）實現(xiàn)的，隆起的下端（褶緣）是分生中心，楊祝良（1995）對毒蠅鵝膏（A.muscaria）和變紅鵝膏（A.rubescens）的個體做了顯微觀察，認為褶緣并非子實層分生區(qū)。他認為子實層發(fā)生有先后之分，它在子實層原基中相隔一定距離不同點啟動后向菌內(nèi)或相反方向推進，之后連成褶片。而我們對子實體進行連續(xù)切片觀察表明，灰花紋鵝膏子實層的發(fā)生無明顯先后之分，褶緣細胞并不形成擔子，它們是與菌柄菌幕同一起源的菌髓細胞膨大形成；其附近的子實層也不是分生中心。菌褶的形成很可能亦不是離心隆起方式實現(xiàn)的；因為剛分化出菌褶原基時，菌髓細胞與菌肉細胞和菌柄細胞是緊密相聯(lián)的細長菌絲體，結(jié)構(gòu)上無顯著差異，隨著蓋原基的發(fā)育，菌髓菌絲細胞逐漸與菌肉細胞及菌柄菌幕細胞垂直，由于菌絲細胞分裂變長的速度快于變粗的速度，菌肉組織的橫向增長快于子實層體原基的增粗，因此出現(xiàn)菌褶腔。輻射狀排列的菌褶形成依賴于基因時序表達的精確調(diào)控。

灰花紋鵝膏菌擔子發(fā)育，一般形成4個二核擔孢子。觀察灰花紋鵝膏菌的擔孢子，絕大多數(shù)為二核擔孢子，應是灰花紋鵝膏菌正常發(fā)育的擔孢子類型；在灰花紋鵝膏菌擔孢子發(fā)生過程中，也有極少數(shù)為單核、三核或四核擔孢子，不是灰花紋鵝膏菌正常發(fā)育的擔孢子類型，它們的產(chǎn)生，可能是擔子中的細胞核在向擔孢子遷移的過程中出錯所致。通過對分離培養(yǎng)的灰花紋鵝膏菌菌絲體的觀察，未發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合之類的特征性結(jié)構(gòu)，推測其產(chǎn)生的二核擔孢子為同核孢子。但遺憾的是目前尚不能人工培養(yǎng)出灰花紋鵝膏菌子實體，不能對二核擔孢子的交配類型進行驗證。

熒光染料Hoechst 33258能特異性地與核DNA結(jié)合，因此排除了常規(guī)染色法如蘇木精或吉姆薩（Giemsa）染液染色中對中心粒及核仁染色的干擾，重現(xiàn)性好，且通過熒光信號進行檢測，可以觀察到在細胞中保持自然狀態(tài)的核或染色體，是研究真菌減數(shù)分裂等核行為及觀察染色體數(shù)目的有效試劑。在灰花紋鵝膏菌菌絲體和擔子中，有絲分裂和減數(shù)第一次分裂時期都能觀察到染色體排列成環(huán)狀，而且還觀察到擔子中第一次減數(shù)分裂形兩個“上星環(huán)”后，第2次減數(shù)分裂隨即發(fā)生，呈現(xiàn)一個擔子中4個“土星環(huán)”的結(jié)構(gòu)。通過熒光染色方法，觀察到灰花紋鵝膏菌基因組染色體數(shù)目為10條。