趙文瑾 劉丹丹 鐘連聲 何 群 趙雨杰

摘 要：通過siRNA技術(shù)抑制癌胚抗原相關(guān)粘附分子CEACAM1在人急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系BALL-1中的表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)研究異常表達(dá)于白血病B細(xì)胞的CEACAM1對細(xì)胞增殖的影響。 應(yīng)用CCK-8法測定細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)CEACAM1表達(dá)下調(diào)后BALL_-1細(xì)胞的增殖能力明顯下降。 細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示CEACAM1被抑制后細(xì)胞增殖狀態(tài)表現(xiàn)為S期細(xì)胞百分比降低，G0/G1期細(xì)胞比例升高，提示CEACAM1表達(dá)下調(diào)是通過引起細(xì)胞周期停滯在G0/G1期來降低細(xì)胞增殖的，表明CEACAM1本身對自血病B細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用

關(guān)鍵詞：CEACAM1：白血病B細(xì)胞：增殖

中圖分類號：R34

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）06-0516-05

癌胚抗原相關(guān)粘附分子CEACAM家族包括CEACAM1、CEACAM3、CEACAM5、CFACAM6.CEACAM8，隸屬于免疫球蛋白超家族。CEA-CAM1，又名BGP或CD66a，是CEACAM家族的主要亞型之一，廣泛分布于人體內(nèi)多種組織。在血液系統(tǒng)中，除了CEACAM5只存在于卜皮細(xì)胞與血細(xì)胞系統(tǒng)無關(guān)外，CEACAM1與其他CEA -CAM成員都存在于髓細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞，尤其是成熟中性粒細(xì)胞。CEACAM1是白細(xì)胞表而的膜分化抗原之一，其作為粘附分子與細(xì)胞增殖，凋亡，侵襲，轉(zhuǎn)移有關(guān)。正常血液中，CFACAM家族的表達(dá)只局限于髓細(xì)胞，淋巴細(xì)胞不表達(dá)CEACAM分子，但多位研究者卻在急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-急淋）病例中發(fā)現(xiàn)癌變的B淋巴細(xì)胞表面有CEACAM家族的表達(dá)，且分子亞型多為CEACAMl或CEACAM6。雖然CEACAMl異常表達(dá)于白血病B細(xì)胞的現(xiàn)象已廣泛報(bào)道，但是這種異常表達(dá)對白血病B細(xì)胞造成的功能效應(yīng)日前卻罕有了解，因此本文以B-急淋白血病細(xì)胞系BALL-l為研究對象，通過小干擾RNA （siRNA）技術(shù)下調(diào)CEACAM1表達(dá)，探討CEACAMl對白血病B細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系BALL-1（Riken Cell Bank，日本）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone，美國）；無血清培養(yǎng)基Opti-MFM （Iilvit-rogen，美國）；Trizol試劑 （Invitrogen，美國）；RT-PCR試劑盒與SYBR Green QRT-PCR試劑盒（Takara，日本）；FITC標(biāo)記的小鼠抗人pan-CFA-CAM單抗及小鼠IgG抗體（BD Pharmingen，美國）；兔抗人pan-CEACAM多抗、小鼠β-actin單抗（Santa Cruz，美國）；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗（武漢博上德公司）；膜蛋白提取試劑盒（南京凱基公司）；ECL試劑盒（Thermo Scientific，美國）；CCK-8試劑盒及細(xì)胞周期檢測試劑盒（上海碧云生物公司）；電轉(zhuǎn)杯（BIO-RAD，美國）；電穿孔儀ECM 830（BTX.美國）；PCR引物均山Takara公司合成；CEACAMl-siRNA和陰性對照SiRNA由蘇州吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

BALL-1細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基并放置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃、5% CO2、飽和濕度。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測CFACAM表達(dá)

5xl0 5 BALL-1細(xì)胞用PBS溶液清洗3次后，重懸于80μL PBS 并加入20μL FITC標(biāo)記的pan-CEACAM 單抗置4 ℃避光孵育30 min，然后用PBS溶液清洗3次，重懸于500μL PBS溶液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀及CeIIQuest軟件進(jìn)行檢測分析。同型IgG陰性對照用于評估背景熒光強(qiáng)度。

1.2.3 RT-PCR檢測CEACAM亞型

Trizol法提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄后做PCR擴(kuò)增。引物如下：CEACAMl， 5'-ACAGCAGCCGTGCTCGAAGC-3和5-TGGACAGCTGCAGC-CTGCGA-3（產(chǎn)物659 bp）；CEACAM3，5-TCT-AAACTTCTGGAACCCGCC-3和5-TCCAGTT -TTGGCAAGGAGCAG-3'（ 產(chǎn)物469 bp）；CEA -CAM6，5-GCTCTGATATAGCAGCCCTGGTG-3和5-CTTCAGGAGCAGAGCAGACCTG-3（產(chǎn)物141 bp）； CEACAM8， 5'-CTGACAGCCGTGCT-CAGAAAC -3和 5-CAGTTGTAGCCACGAG-GGTC -3 （產(chǎn)物275 bp）；內(nèi)參β-actin，5-TG-GCACCCAGCACAATGAA-3和 5-CTAAGTCA-TAGTCCGCCTAGAAGCA-3（產(chǎn)物186 bp） 。 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)熱5min，94℃變性30s，60℃復(fù)性40 s.72℃延伸1 min， 30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5min取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4

siRNA電穿孔轉(zhuǎn)染沉默CEACAM1基因

2xl0 6 BALL-1細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基Opti-MEM清洗并重懸，200 μL細(xì)胞懸液中加入5μgSiRNA置于電轉(zhuǎn)間距為0.4 cm的電轉(zhuǎn)杯中，應(yīng)有電穿孔儀在電壓340 V，電擊時(shí)間4 ms條件下進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)后加入完個(gè)培養(yǎng)基在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。所用siRNA序列如下：siCEA -CAM1，正義鏈5-GACCCACCUAACAAGAUGA-TT -3'和反義鏈5'-UCAUCUUGUUAGGUGGG-UCTT-3；陰性對照sicontrol，正義鏈5-UUCUC-CGAACGUGUCACGUTT-3和反義鏈5-ACGU-GACACGUUCGGAGAATT-3未加任何siRNA的電穿孔細(xì)胞作為空白對照。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測（quantitative real timePCR. QRT-PCR）

轉(zhuǎn)染36 h后，為檢測CEACAM1基因沉默結(jié)果，提取各組電穿孔細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行QRT-PCR，采用△△CT法計(jì)算，比較各組細(xì)胞mRNA變化擴(kuò)增條件：95℃預(yù)熱30s，95℃變性5 s，60 ℃復(fù)性20s，40個(gè)循環(huán)CEACAM1引物如下：5-GACCACTCCAATGACCCACC-3和5-GGGAGGCTGAAGTTGGTTGT-3。β-actin作為內(nèi)參基因（引物同上）。每組細(xì)胞均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.2.6

WeSten-blot檢測CEACAM1蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后，為檢測CEACAMl蛋白表達(dá)下調(diào)結(jié)果，提取各組電穿孔細(xì)胞膜蛋白。蛋白定量后，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將分離的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。封閉，洗膜，與一抗、二抗孵育，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色成像。一抗分別為兔抗人pan-CEACAM多抗、小鼠β-actin單抗，二抗為羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗。

1.2.7 CCK-8法測定細(xì)胞增殖

為檢測CEACAM1抑制后對白血病B細(xì)胞增殖的影響，分別在轉(zhuǎn)染后12、24、36、48 h用CCK-8法測定細(xì)胞增殖情況。將各組電穿孔細(xì)胞加入96孔板中（3 000個(gè)/孔），同時(shí)設(shè)僅含有D1VIEM培養(yǎng)液的空白孔用于調(diào)零，每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔：每孔加入l0μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h.用酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm測吸光值，結(jié)果取5孔平均值。

1.2.8流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期

轉(zhuǎn)染48 h后，各組細(xì)胞用PBS清洗后，以70%乙醇固定，4 ℃過夜。然后再次用PBS清洗3次，加入500μL細(xì)胞周期檢測試劑盒里的反應(yīng)液及10μg/mL碘化丙啶（PD，37 ℃避光孵育30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀和Modfit LT軟件分析染色細(xì)胞。

1.2.9統(tǒng)計(jì)分析

兩組變量之問差異采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEACAM1在BALL-1細(xì)胞膜上的表達(dá)及亞型分析

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示BALL-l細(xì)胞表而呈CEACAM抗原陽性表達(dá)（圖1A）。因所用的流式抗體pan -CEACAM可識別CEACAM1等多個(gè)CFACAM家族成員，所以本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)計(jì)了CEACAM1、3、6、8 四種亞型的引物用于RT-PCR擴(kuò)增，在核酸水平上檢測BALL-l細(xì)胞所表達(dá)的CEACAM抗原是何種亞型。電泳結(jié)果顯示RALL-1細(xì)胞只表達(dá)CEACAMl （圖1B）。

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CEACAM1表達(dá)下調(diào)的檢測

經(jīng)電穿孔技術(shù)將CEACAM1 siRNA轉(zhuǎn)染到BALL-1細(xì)胞后，應(yīng)用QRT-PCR方法在核酸水平上檢測CEACAMl基因沉默效果。結(jié)果顯示陰性對照組（sicontrol）與空白對照組（mock）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而siCEACAMl組的CEACAMl mRNA水平與陰性對照組相比下降近5倍（圖2A）。另外，應(yīng)用Western-blot方法在蛋白水平上也證實(shí)了siCEACAM1組中的CEACAMl表達(dá)水平明顯下降（圖2B）。

2.3 CEACAM1表達(dá)下調(diào)對BALL-1細(xì)胞增殖的影響

應(yīng)用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后BALL-1細(xì)胞的增殖能力，圖3結(jié)果顯示siCEACAMl組細(xì)胞增殖能力明顯低于陰性對照組（P<0.05）.而空白對照組（mock）與陰性對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

2.4 細(xì)胞周期分析

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期，觀察CEACAMI抑制后對BALL-1細(xì)胞周期的影響。在細(xì)胞周期分析圖中，第一峰代表G0/G1期細(xì)胞，第二峰代表G2/M期細(xì)胞，S期細(xì)胞介于兩峰之間。圖4結(jié)果顯示siCEACAMI組的S期細(xì)胞百分比從34.35%（陰性對照組）降至19.22%，且G0/G1期細(xì)胞比例增加（P0.05），陰性對照組與空白對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示CFACAM1表達(dá)下凋后抑制細(xì)胞從G0 /G1期進(jìn)入S期，從而引起增殖下降。

3 討論

白血病細(xì)胞與正常白細(xì)胞相比往往呈現(xiàn)蛋白表達(dá)譜的改變，最常見的就是白血病細(xì)胞膜上分化抗原的改變，如原本表達(dá)于髓細(xì)胞的CEACAM家族就足異常表達(dá)于B-急淋白血病細(xì)胞上的抗原分子，CEACAM1是其中主要亞型。由于白血病主要是分化不成熟的異常白細(xì)胞因增殖失控而大量累積，導(dǎo)致正常造血受抑制的惡性克隆性疾病，因此本實(shí)驗(yàn)的工作目標(biāo)著重于研究CEACAM1異常表達(dá)對白血病B細(xì)胞增殖的影響。

通過流式細(xì)胞儀和RT—PCR檢測，證明急性B淋巴性白血病細(xì)胞株BALL-1只表達(dá)CEACAM家族里的CEACAMl，因此本實(shí)驗(yàn)選取BALL-l進(jìn)行CEACAM1的研究。CEACAM1主要的生物學(xué)功能是通過同嗜性相瓦作用介導(dǎo)細(xì)胞粘連，也可以通過異嗜性相互作用與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，還可以作為效應(yīng)因子參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究應(yīng)用siRNA技術(shù)抑制CEACAM1表達(dá)會(huì)導(dǎo)致其同嗜性結(jié)合的減少，削弱細(xì)胞間CEACAMl-CEA-CAM1相互作用，從而改變CEACAM1對白血病B細(xì)胞的影響。本研究通過對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖檢測發(fā)現(xiàn)CEACAM1表達(dá)下調(diào)后BALL-1細(xì)胞的增殖能力明顯下降，且根據(jù)細(xì)胞周期分析結(jié)果可見其增殖狀態(tài)表現(xiàn)為S期細(xì)胞百分比的降低并伴隨G0/Gl期的細(xì)胞聚集，C2/M期細(xì)胞數(shù)則基本沒有變化，意味著CEACAM1被抑制后是通過引起細(xì)胞周期停滯在G0/G1期來降低細(xì)胞增殖的，表明CEACAMl本身對白血病B細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用。該結(jié)果與國外一些學(xué)者的報(bào)道一致，他們發(fā)現(xiàn)在某些癌癥中如甲狀腺癌、非小細(xì)胞肺癌、惡性黑色素瘤等CEACAM1表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)行性生長，并與轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良高度相關(guān)。最新報(bào)道也揭示了CEACAM1異常表達(dá)對白血病B細(xì)胞有促進(jìn)增殖及抑制凋亡的作用，這些作用與CEACAMl-L和CEACAM-S兩個(gè)變異體之間的表達(dá)比例有關(guān)。本文則研究了CEACAM1異常表達(dá)對于細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)抑制CEACAM1可以引發(fā)白血病B細(xì)胞周期停滯。

綜上所述.本研究確立了CEACAM1對B-急淋白血病細(xì)胞的促增殖作用及對細(xì)胞周期的影響，但其分子機(jī)制尚不清楚。深入分析CEACAM1對白血病細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制及其異常表達(dá)于B-急淋白血病的發(fā)生機(jī)制，有助于拓展對B-急淋的認(rèn)識并能為B-急淋的治療提供潛在靶點(diǎn)。