任思竹 陳青君 程繼鴻

摘要 [目的]研究碳源、氮源對蜜環(huán)菌生長的影響。[方法]選用6種不同碳源和8種不同氮源的培養(yǎng)基，通過測定搖瓶淺層培養(yǎng)后蜜環(huán)菌菌球的生物量，探討不同的營養(yǎng)源對蜜環(huán)菌生長的影響。[結(jié)果]最佳的培養(yǎng)條件為：在培養(yǎng)溫度25 ℃、振蕩器轉(zhuǎn)速為150 r/min的黑暗環(huán)境中恒溫培養(yǎng)10 d；最適碳源、氮源分別是蔗糖和酵母膏，菌球生物量分別達到（10.60±2.70）和（3.95±3.55） g/L。[結(jié)論]該方法為供試蜜環(huán)菌的培養(yǎng)基篩選及進一步研究天麻、豬苓的共生特性提供了理論基礎。

關鍵詞 淺層培養(yǎng)；蜜環(huán)菌；營養(yǎng)源；生物量

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-04974-04

蜜環(huán)菌[Armillaria mellea （Vahl ex Fr.）Quel]是一種藥（食）用菌[1]，與藥用植物天麻[2]（Gastrodia elata Bl）和真菌豬苓（Grifola umbellate）相伴生[3]。1790年Vahl首次鑒定蜜環(huán)菌，研究表明蜜環(huán)菌可以引起多種針葉、闊葉樹木的根腐病，寄主植物多達300屬之多[4]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)蜜環(huán)菌共34種，其中歐洲分布5種，非洲2種，北美7種，澳大利亞5種，日本6種，中國記載有9種[5]。蜜環(huán)菌藥用價值大，有預防失眠[6]、抗驚厥[7]、抗衰老[8]、抗腫瘤[9]等功效。

蜜環(huán)菌同大多數(shù)微生物類似，在不同的碳源下，呼吸途徑不同，產(chǎn)能也不相同[10]。由菌絲體形成菌索是蜜環(huán)菌的一個重要特征。試驗試圖在基礎培養(yǎng)基中添加相同碳含量的糖和相同氮含量營養(yǎng)物質(zhì)對蜜環(huán)菌菌索生長的影響，通過測量蜜環(huán)菌菌球生物量和直徑等參數(shù)，以期為供試蜜環(huán)菌在培養(yǎng)基篩選及進一步研究天麻、豬苓的共生特性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。蜜環(huán)菌8號，由北京農(nóng)學院植物科學技術學院自行分離，保存于0～4 ℃的木屑培養(yǎng)基中。

1.1.2 主要試劑。供試碳源分別為葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和淀粉；供試氮源分別為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨和碳酸氫銨，市售。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及液體一級菌種的制備。①菌種活化。將保存的木屑菌種接種在PDA培養(yǎng)基平板上進行一次活化，于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)15 d，當菌落長滿培養(yǎng)皿后使用。②液體1級菌種。于500 ml三角瓶中裝入200 ml去除瓊脂后的PDA液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接種體積約0.1 cm2培養(yǎng)皿母種 3～5塊后，于黑暗25 ℃，150 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)10 d。

1.2.2 碳源液體培養(yǎng)基制備。①基礎培養(yǎng)基。去皮馬鈴薯200 g煮汁、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、水1 000 ml、pH值自然。②供試碳源培養(yǎng)基。保持培養(yǎng)基中碳含量等量，分別在基礎培養(yǎng)基中加入葡萄糖20 g，果糖20 g，蔗糖31.64 g，麥芽糖33.32 g、乳糖31.65 g，淀粉29.96 g，制成不同的碳源培養(yǎng)基，200 ml液體裝入500 ml的搖瓶中，3次重復。

1.2.3 氮源液體培養(yǎng)基制備。①基礎培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基。②供試氮源培養(yǎng)基。保持培養(yǎng)基中氮含量相等，即每升基礎培養(yǎng)基中加入蛋白胨34.48 g，牛肉膏38.46 g，酵母膏78.12 g、尿素10.72 g、硫酸銨23.59 g、硝酸銨14.29 g、氯化銨19.10 g、碳酸氫銨28.21 g。

1.2.4 滅菌冷卻。透氣膜和牛皮紙封口后滅菌（121 ℃，30 min，0.101 MPa），冷卻后接種。

1.2.5 接種及培養(yǎng)方法。用已準備好的液體1級菌種，倒入滅菌徹底的小燒杯中20 ml，轉(zhuǎn)接于各搖瓶中，置于25 ℃的恒溫搖床中（相對濕度70%，150 r/min，黑暗）培養(yǎng)10 d待測。

1.2.6 測量。①菌球直徑。將100目的細胞篩過濾發(fā)酵液，在稱量紙上隨機挑取10個菌球緊密排成一排，刻度尺測量總長度，計算出菌球平均直徑，每個處理3次重復。②生物量干重。將液體培養(yǎng)基中菌絲球全部濾出，于80 ℃烘干24 h后稱重。

1.2.7 試驗數(shù)據(jù)分析。將所得數(shù)據(jù)按不同的培養(yǎng)基成分整理，采用DPS V7.5軟件進行分析， 方差分析采用Duncan新復極差法處理，大寫字母表示達到1%極顯著水平差異，小寫字母表示達到5%顯著水平差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對蜜環(huán)菌生長的影響 由表1～2綜合分析可知，6種碳源均可被蜜環(huán)菌利用，但能力存在差異。其中以蔗糖為碳源，蜜環(huán)菌菌球生物量最大，達到10.60 g/L，同其他糖類相比有著極顯著優(yōu)勢（P<0.01）；其次是可溶性淀粉，達到3.45 g/L，葡萄糖和果糖二者之間存在差異不明顯（P>0.05），菌球生物干重分別為2.50和2.45 g/L；乳糖較差，菌球生物干重1.95 g/L；麥芽糖菌球生物干重最小，僅為1.20 g/L，以菌球生物量為指標，搖瓶淺層培養(yǎng)基中最適宜碳源是蔗糖。菌球直徑小，單位體積內(nèi)的菌絲球數(shù)就會越多，接種時萌發(fā)點多有利于下一級的擴繁，在各種糖原中蔗糖的直徑最小，為0.22 cm，并且其成本也很低，所以最適碳源最終確定為蔗糖。

2.2 不同氮源對蜜環(huán)菌菌球生物量的影響 將蜜環(huán)菌菌種在不同的氮源下培養(yǎng)，由表3～4可知，蜜環(huán)菌均可利用試驗設計的8種氮源，但在不同氮源培養(yǎng)基的影響下，蜜環(huán)菌的菌絲球生長存在顯著差異（P<0.05）。其中酵母膏和蛋白胨為氮源，菌球生物量干重最大，分別達到3.95和3.85 g/L，二者之間無顯著差異（P>0.05），但與其他處理間存在差異（P<0.05）；牛肉膏和氯化銨的菌絲生物干重分別為3.00和2.00 g/L，硝酸銨、硫酸銨、尿素3種氮源無顯著性差異（P>0.05），生物量均較少。以碳酸氫銨為氮源的菌絲生物量最小，僅為0.25 g/L，與其他培養(yǎng)基相比相差較遠。以菌絲生物量為指標，淺層培養(yǎng)蜜環(huán)菌最好的氮源是酵母膏和蛋白胨，但考慮到酵母膏成本偏高，菌球（0.28 cm）較蛋白胨的直徑（0.18 cm）大，建議小規(guī)模試驗選擇酵母膏作氮源，而在工業(yè)化生產(chǎn)中進行繼代培養(yǎng)時選蛋白胨更優(yōu)（圖1）。

3 結(jié)論與討論

蜜環(huán)菌是天麻、豬苓等賴以生存的支柱，好的蜜環(huán)菌菌種除與菌株本身的遺傳特性有關外，還依賴于培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)基質(zhì)所提供的養(yǎng)分，只有在比較充足的營養(yǎng)環(huán)境下，生理功能才能正常完成，性狀才能得以穩(wěn)定的表達[11]。碳源、氮源是最基本的生長因子[12]，碳源構(gòu)成菌體細胞，提供能量來源；氮源為合成蛋白質(zhì)和核酸不可或缺的原料[13]。只有篩選出最適碳源、氮源，才可以為獲得較高菌絲生物量。試驗以蜜環(huán)菌菌球干重為主要指標，菌球直徑為輔助指標，篩選出了適合北農(nóng)8號蜜環(huán)菌生長的碳源為蔗糖，氮源為酵母膏和蛋白胨。試驗數(shù)據(jù)充分表明，蜜環(huán)菌種類、來源不同對營養(yǎng)條件的要求也有所不同，對不同碳源、氮源的利用有著較大差異。程顯好等研究認為，甘露醇是最適宜的碳源，而劉天貴和胡尚勤的研究表明葡萄糖為最佳碳源，也有認為蛋白胨、酵母膏為最佳氮源的報道[14]。

此外，在進行對比試驗時，曾將蜜環(huán)菌作為培養(yǎng)皿固體或半固體培養(yǎng)基質(zhì)進行試驗，通過觀測蜜環(huán)菌在固體或半固體內(nèi)菌索的干重、長速、滿皿時間等指標，但其生長周期較長，辨識度較低。相對比，液體淺層培養(yǎng)的方法操作更為簡單，結(jié)果更可靠，效果更明顯，并且大大的節(jié)省了去除瓊脂等繁文縟節(jié)性的工作。在進行培養(yǎng)皿內(nèi)固體碳源的比較時發(fā)現(xiàn)，各種碳源培養(yǎng)基長勢都過于緩慢，獲得純凈菌索的差異較小，對比度不大；在氮源比較中，與蜜環(huán)菌在搖瓶培養(yǎng)中得到的結(jié)果基本一致，所以最終的結(jié)論確定為蜜環(huán)菌在以蛋白胨為氮源做培養(yǎng)基的情況下，最適宜生長，而對于不同營養(yǎng)因子之間的合理搭配等研究，需要在后續(xù)設計正交試驗才可以確定。

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責任編輯 姜麗 責任校對 況玲玲