姚丹靜 曲弈 陳金慧

摘要：為探索脯氨酸在杉木胚性愈傷組織超低溫冷凍保存過程中的作用，本試驗以繼代14 d的杉木愈傷組織為材料，在預處理階段設置不同濃度的脯氨酸，采用TTC法測定相應的細胞存活率。結(jié)果表明：預處理階段，脯氨酸濃度為05 g·L1時，細胞存活率相對最高。說明了在預處理階段添加適宜濃度的脯氨酸可提高超低溫冷凍保存的存活率。

關鍵詞：脯氨酸；超低溫冷凍保存；杉木；胚性愈傷組織

中圖分類號：S722.3+7文獻標識碼：A文章編號：1004-3020（2014）03-0030-03

The Influence of Prolin on Cryopreservation of Callus of Cunninghamia lanceolata

Yao DanjingQu YiChen Jinhui

（College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry UniversityNanjing210037 ）

Abstract： To explore the role of prolin in the process of cryopreservation of embryogenic callus of Cunninghamia lanceolata，the cell survival of 14 days callus of Cunninghamia lanceolata of subculture was measured by the TTC method with different concentrations of proline in the pretreatment stage.The result showed that： in the pretreatment stage， when the concentration of proline was 0.5 g·L1，the cell survival was relatively the highest.It suggested that adding suitable concentration of proline in the pretreatment stage can improve the survival of cryopreservation.

Key words：prolin；cryopreservation；Cunninghamia lanceolata；embryogenic callus

杉木Cunninghamia lanceolata是我國特有的速生商品材樹種，被廣泛應用于木材和藥用方面。目前利用杉木成熟合子胚能成功實現(xiàn)體胚發(fā)生 [1 ]，但是經(jīng)過長時間的繼代培養(yǎng)，體胚發(fā)生的能力會逐漸降低直至喪失。將超低溫冷凍保存技術(shù)和杉木胚性愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來，能長期保存植物材料并保證其遺傳穩(wěn)定性，可有效解決杉木胚性愈傷組織體胚發(fā)生能力衰退的問題 [2 ]。同時，脯氨酸可以提高植物對低溫的耐受性 [3，4 ]，其在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調(diào)節(jié)細胞氧化還原勢等方面有著重要作用；另外還能作為植物細胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、降低凝固點，防止細胞脫水 [5 ]。本試驗在已研究的杉木胚性愈傷組織超低溫冷凍保存技術(shù)的基礎上，探討在預處理階段，不同濃度的脯氨酸對杉木胚性愈傷組織超低溫冷凍結(jié)果的影響。

1材料與方法

本試驗采用玻璃化冷凍法 [6 ]，對杉木胚性愈傷組織進行超低溫冷凍保存。

1.1試驗材料

本試驗利用實驗室誘導的胚性愈傷組織為起始材料，對經(jīng)過14 d繼代培養(yǎng)的材料進行超低溫冷凍保存試驗。

1.2試驗方法

本試驗在預處理階段設置不同濃度的脯氨酸，每個濃度設置3組重復，取預培養(yǎng)20 d與復蘇階段的杉木胚性愈傷組織，測定細胞相對存活率。

1.2.1杉木愈傷組織繼代培養(yǎng)

杉木胚性愈傷組織在改良的DCR培養(yǎng)基上能實現(xiàn)穩(wěn)定增殖，具有體胚發(fā)生的能力。繼代培養(yǎng)基為DCR+VC 10 mg·L1+2，4-D 10 mg·L1+BA 05 mg·L1+KT 05 mg·L1，谷氨酰胺045 g·L1，肌醇01 g·L1，水解酪蛋白05 g·L1，活性炭25 g·L1，水晶洋菜24 g·L1，麥芽糖20 g·L1，pH53。在23 ℃下暗培養(yǎng)，每25 d為1個繼代周期。

1.2.2杉木愈傷組織超低溫冷凍保存

（1）預培養(yǎng)：杉木胚性愈傷組織在不含激素的DCR固體培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)，23 ℃暗培養(yǎng)21 d。

（2）預處理：杉木胚性愈傷組織在添加05 mol·L1山梨醇的高滲固體培養(yǎng)基上進行預處理，添加不同濃度的脯氨酸（濃度0，05，10，20 g·L1），23 ℃暗培養(yǎng)5 d。

（3）冷凍方法：無菌條件下，將預處理后的杉木胚性愈傷組織放入18 mL冷凍管，每管05～06 g，加入冷凍液（含06 mol·L1山梨醇+10%DMSO的液體培養(yǎng)基），在冰上預冷20 min后吸去冷凍液，再次加入冷凍液，將冷凍管放入程序降溫儀以-1 ℃/min 的速率梯度降溫至-90 ℃，于液氮中保存，至少2 d以后進行解凍復蘇。

（4）解凍與洗滌：將冷凍2 d以上的杉木胚性愈傷組織從液氮罐中取出，置于37 ℃水浴鍋中解凍2 min，化凍后即用復蘇液（含07 mol·L1山梨醇的液體培養(yǎng)基）洗滌3次。

（5）復蘇與再培養(yǎng)：將解凍后的杉木胚性愈傷組織接種到含04 mol·L1山梨醇的固體培養(yǎng)基中，23 ℃暗培養(yǎng)2 d；2 d后，再將其接種到含02 mol·L1山梨醇的固體培養(yǎng)基中，23 ℃暗培養(yǎng)2 d。

（6）細胞生活力的測定：采用TTC法 [7 ]測定細胞存活率。稱取100 mg待測材料，加15 mL04%TTC溶液，15 mL磷酸緩沖液（pH7，01 mol·L1），靜置于23 ℃暗處。21 h后去上清液，加入5 mL蒸餾水洗滌細胞，重復3次。加入5 mL 95%乙醇，置于60 ℃水浴中30 min，期間輕輕搖動1～2次，靜置于室溫下至細胞無色。取上清液，在分光光度計485 nm處測吸光值。用相對存活率表示細胞的活力。

細胞相對存活率= 解凍后細胞TTC值未冷凍細胞TTC值×100%

2結(jié)果與分析

2.1杉木胚性愈傷組織超低溫冷凍保存過程的生長狀況

繼代14 d的杉木胚性愈傷組織外觀呈白色，細胞飽滿含水豐富（圖1A）；經(jīng)預培養(yǎng)18 d后，杉木胚性愈傷組織顏色偏黃，略有失水現(xiàn)象（圖1B）；預處理4 d，細胞呈黃褐色，高滲透壓使愈傷組織出現(xiàn)了明顯的失水現(xiàn)象，細胞質(zhì)濃縮，該狀態(tài)有利于冷凍（圖1C）；高滲復蘇3 d的杉木胚性愈傷組織生長緩慢，沒有新愈傷組織出現(xiàn)（圖1D）；復蘇27 d的杉木胚性愈傷組織長出新愈傷組織（圖1E）； 冷凍后恢復繼代培養(yǎng)的杉木胚性愈傷組織與未經(jīng)過冷凍處理的杉木胚性愈傷組織相比，含水量較多，刺狀結(jié)構(gòu)較少，愈傷組織細胞較為黏稠（圖1F）。

圖1杉木胚性愈傷組織各階段的狀態(tài)

A.繼代培養(yǎng)的杉木胚性愈傷組織；B.預培養(yǎng)18 d的杉木胚性愈傷組織；C.預處理4 d的杉木胚性愈傷組織；D.高滲復蘇3 d的杉木胚性愈傷組織；E.復蘇27 d的杉木胚性愈傷組織；F.恢復繼代培養(yǎng)的杉木胚性愈傷組織。

2.2脯氨酸濃度對杉木胚性愈傷組織存活率的影響

取預培養(yǎng)20 d與復蘇階段的杉木胚性愈傷組織，經(jīng)過處理后，測其在分光光度計485 nm處的吸光值，通過公式計算，將細胞相對存活率繪制成圖2。

在預處理階段，添加不同濃度的脯氨酸對杉木胚性愈傷組織存活率有一定影響。由圖2可以看出，當預處理階段脯氨酸濃度為05 g·L1時，細胞存活率相對最高。

3討論

目前，許多關于植物愈傷組織的超低溫冷凍保存研究都已見報道，但少有人研究脯氨酸對植物愈傷組織超低溫冷凍保存的影響。本試驗在已研究的杉木胚性愈傷組織的超低溫冷凍保存技術(shù)的基礎上，探討脯氨酸在其過程中的作用。試驗在預處理階段添加不同濃度的脯氨酸，以探求最適宜的脯氨酸濃度，使得冷凍后存活率更高。試驗結(jié)果表明：在預處理階段，脯氨酸濃度為05 g·L1時，細胞存活率相對最高。另外，通過試驗可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過預處理的杉木胚性愈傷組織明顯失水，細胞質(zhì)均高度濃縮，該狀態(tài)有利于超低溫冷凍保存，由此可見預處理是促進細胞質(zhì)濃縮較為關鍵的一步。

參考文獻

[1]席夢利，施季森.杉木成熟合子胚器官發(fā)生和體胚發(fā)生 [J ].林業(yè)科學，2006，42（9）：29-33.

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（責任編輯：鄭京津）