楊靜

摘要 [目的]研究苯丙氨酸、草酸和油酸等前體對黃芪細(xì)胞生長和黃芪多糖合成的影響。[方法]在細(xì)胞培養(yǎng)的第0天，向細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中加入3種前體，測定細(xì)胞干重增殖倍數(shù)和黃芪多糖的含量。[結(jié)果]添加2 mmol/L的草酸可以明顯地促進(jìn)黃芪細(xì)胞中黃芪多糖的積累，其含量為對照組的1.80倍；較低濃度苯丙氨酸能有效促進(jìn)黃芪細(xì)胞中黃芪多糖的合成；當(dāng)苯丙氨酸濃度為1.0 mmol/L，黃芪多糖的含量達(dá)最大，為33.429 mg/g，為對照組的1.70倍；當(dāng)油酸添加濃度由0.1 mmol/L增加至2 mmol/L時，細(xì)胞中黃芪多糖的含量逐漸提高；2 mmol/L的油酸使黃芪多糖的含量達(dá)37.565 mg/g，為對照組的1.91倍。[結(jié)論]前體的添加可有效促進(jìn)黃芪懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中黃芪多糖的積累。

關(guān)鍵詞 前體；黃芪多糖；積累；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；黃芪

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）27-09317-03

Effect of Different Precursors on Accumulation of Astragalus Polysaccharides in the Suspension Culture Cell of Astragalus membranaceus

YANG Jing （Tianjin Bohai Vocational and Technical College， Tianjin 300402）

Abstract [Objective] To investigate the effects of different precursors （oxalic acid， phenylalanine， oleic acid） on the cell growth and the formation of astragalus polysaccharides in Astragalus membranaceus cells. [Method] The three kinds of precursors were added to the suspension culture cell on the day 0. Then the cell growth rate and the astragalus polysaccharides content in Astragalus membranaceu cells were determined. [Result] The addition of 2 mmol/ L oxalic acid could significantly increase the accumulation of astragalus polysaccharides by about 1.80 times than the control. The low concentration of phenylalanine can effectively stimulate the synthesis of astragalus polysaccharides. The content of astragalus polysaccharides reached 33.429 mg/g by adding 1.0 mmol/L phenylalanine， and it was 1.70 times as that of control. With the addition of 2 mmol/L oleic acid， astragalus polysaccharides content reached to 37.565 mg/g by 1.91 times than the control. [Conclusion] The addition of the precursors was effective to promote the formation of astragalus polysaccharides in Astragalus membranaceus cells.

Key words Precursors； Astragalus polysaccharides； Accumulation； Suspension culture cell； Astragalus membranaceus

黃芪又名北芪、元芪或黃耆，豆科多年生草本植物，根為重要的中藥材。目前我國可供藥用的黃芪品種很多，但主要以膜莢黃芪和蒙古黃芪為主。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黃芪具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、斂瘡生肌、補(bǔ)中益氣等功效^[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、強(qiáng)心降壓、降血糖、利尿、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗病毒、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用^[2]。由于黃芪藥性溫和，素有補(bǔ)氣固表之“圣藥”的美譽(yù)。以黃芪為原料生產(chǎn)的中成藥多達(dá)200余種，著名的“補(bǔ)中益氣湯”就是由黃芪配伍而成。黃芪中含有多糖、皂苷、黃酮、氨基酸和微量元素等多種有效成分，其中黃芪多糖（Astragalus Polysacharin，APS）是黃芪的主要活性成分之一，具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、促進(jìn)免疫、促進(jìn)抗體合成、雙向調(diào)節(jié)血糖和保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用，可作為免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床^[3]。

目前，隨著保健藥的日益暢銷，黃芪的需求量持續(xù)增加，市場大量需求導(dǎo)致野生資源的過度采挖，野生黃芪瀕臨滅絕。商品中藥材的黃芪主要來源于人工栽培，但受季節(jié)變換和病蟲害的影響，品質(zhì)和產(chǎn)量均有所下降。采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)植物的有效成分，是解決藥材資源問題有效途徑之一，也是對藥材生產(chǎn)的根本性改革。黃芪組織培養(yǎng)方面的報道多集中在黃芪愈傷組織培養(yǎng)和分化及不定根培養(yǎng)方面的研究^[4-5]，對黃芪細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究很少，且利用不同前體添加的手段提高黃芪細(xì)胞中黃芪多糖合成的研究還未有報道。該試驗(yàn)考察了苯丙氨酸、油酸和草酸等3種前體對黃芪細(xì)胞生長和黃芪多糖合成的影響，以期為黃芪細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)黃芪多糖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 黃芪種子（北京時珍中草藥研究所），經(jīng)樂仁堂制藥廠中心化驗(yàn)室鑒定為Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge.的種子。黃芪多糖對照品、葡萄糖對照品購自中國藥品生物制品檢定所。苯丙氨酸、油酸和草酸等試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

202型電熱恒溫干燥箱；TCYQ ZYSA0351型超大型搖床；BCN-1360型凈化工作臺；Sartorius BS 2202S型電子天平；UV- 7500紫外分光光度計；HPG280B強(qiáng)光照培養(yǎng)箱等。

1.3 方法

1.3.1 黃芪無菌苗的獲得。

選擇飽滿的黃芪種子于70%的乙醇中浸泡1 min，用無菌水沖洗2次，然后用2%次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒30 min后，用無菌水浸洗5次。將已滅菌的種子接入培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為MS+3%蔗糖+瓊脂1%、pH5.8、光照16 h培養(yǎng)，4～5 d后種子萌發(fā)，20 d后試管苗長勢良好。

1.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)。

取黃芪無菌苗的幼嫩葉片，自來水沖洗干凈，75%酒精消毒30 s，0.1% HgCl₂消毒7 min，然后無菌水沖洗4次，無菌濾紙吸干水分，切成0.5 cm²的小塊，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為MS+0.5 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA+2.0 mg/L NAA+3%蔗糖+1%瓊脂、pH5.8、黑暗培養(yǎng)、（24±1）℃，挑選生長良好的愈傷組織，稱重后繼代培養(yǎng)，每四周繼代一次，繼代培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L 6BA，其他同誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同前。以上培養(yǎng)基接種前須經(jīng)高壓滅菌，滅菌溫度121 ℃，滅菌時間20 min。

1.3.3 黃芪細(xì)胞株的獲得。

將愈傷組織（約2 g鮮重）轉(zhuǎn)移到含50 ml液體的培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA+3%蔗糖，pH5.8）的250 ml錐形瓶中懸浮培養(yǎng)，每15 d繼代一次，在繼代培養(yǎng)過程中，將大塊尚未分散的愈傷組織去除，同時去除褐化的愈傷組織，懸浮培養(yǎng)時，搖床的轉(zhuǎn)速為120 r/min，（22±1）℃，暗培養(yǎng)。

1.3.4 前體飼喂試驗(yàn)。

油酸用無水乙醇溶解，配成試驗(yàn)用濃度的溶液。苯丙氨酸、草酸和油酸使用前均用微孔濾膜（0.45 μm）進(jìn)行過濾除菌。在培養(yǎng)的第0天向培養(yǎng)基中分別加入0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L的3種前體。培養(yǎng)基pH5.8，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，每組重復(fù) 3～4瓶，以未添加前體的組分作為對照。培養(yǎng)第18天收獲黃芪細(xì)胞。

1.3.5 生物量的測定。

將懸浮細(xì)胞液置于離心管中，轉(zhuǎn)速8 000 r/min，離心15 min，棄去上清液，用蒸餾水洗滌細(xì)胞2～3次，棄去上清液，稱得沉淀細(xì)胞質(zhì)量，即為細(xì)胞鮮重，置于烘箱中60 ℃干燥7～8 h以至恒重，稱其質(zhì)量為細(xì)胞干重。干重增殖倍數(shù)=（收獲時細(xì)胞干重-接種時細(xì)胞干重）/接種時細(xì)胞干重。

1.3.6 黃芪多糖的含量測定。

1.3.6.1 樣品溶液的制備^[6]。

取黃芪細(xì)胞培養(yǎng)物50 ℃下烘干至恒重，粉碎，準(zhǔn)確稱取1.500 g，用濾紙包好置索氏提取器中加入70%的乙醇提取3 h，揮干濾紙包中的乙醇，放于小燒杯中加入20倍量的去離子水超聲，提取110 min。水提液濃縮定容于25 ml的容量瓶中備用。

1.3.6.2 對照品溶液的制備。

精密稱取于105 ℃干燥至恒重的 D-無水葡萄糖100 mg，置100 ml量瓶中加水溶解，定容至刻度，搖勻即得1 μg/ml的對照品溶液。

1.3.6.3 黃芪多糖含量測定方法。精密吸取空白對照品和供試品溶液各2 ml于具塞試管中，分別加入5%苯酚溶液10 ml，搖勻，迅速加入5.0 ml 濃硫酸，振搖2 min，置沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻30 min，以蒸餾水為空白對照，在490 nm 處測定吸光度。根據(jù)回歸方程，計算出相應(yīng)濃度。試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

1.3.6.4 線性范圍考察。

分別精密吸取對照品溶液0.1、02、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ml的溶液于25 ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，精密吸取上述各溶液2 ml于具塞試管中，按照“1.3.6.3”方法測定吸光度。以吸光度對濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=68.703C+0.023 9（r=0. 999 5），結(jié)果表明，葡萄糖在2.0～14.0 μg/ml線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 草酸對黃芪細(xì)胞生長及黃芪多糖含量的影響

從草酸對黃芪細(xì)胞生長及黃芪多糖含量的影響（表1）可以看出，較低濃度（0.1、0.5 mmol/L）下草酸的添加對黃芪細(xì)胞的生長有一定的促進(jìn)作用，并隨著草酸濃度的增加，黃芪細(xì)胞的生物量的積累也逐漸上升；但當(dāng)草酸濃度高于1.0 mmol/L，對黃芪細(xì)胞的生長產(chǎn)生一定的抑制作用；草酸濃度為2.0 mmol/L，黃芪細(xì)胞的干重降為對照組的85.65%。而草酸的加入對于黃芪多糖的積累則表現(xiàn)出不一致的結(jié)果。試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，黃芪多糖含量隨著草酸濃度的增加而增加；當(dāng)草酸的濃度為2.0 mmol/L，黃芪多糖的含量也達(dá)最大，為35.245 mg/g，為對照1.80倍。由此可見，較高濃度的草酸雖然能抑制細(xì)胞生長，卻能顯著提高黃芪細(xì)胞中黃芪多糖的含量。故在培養(yǎng)的第0天向培養(yǎng)體系中添加較高濃度的草酸（2.0 mmol/L），利于黃芪細(xì)胞中黃芪多糖的積累。

NC89懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中添加了對羥苯甲酸等前體物質(zhì)，有效提高了輔酶Q10的含量和煙草細(xì)胞的干重^[7]。該試驗(yàn)在黃芪細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時通過前體的追加來調(diào)控黃芪多糖代謝水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草酸的用量對黃芪多糖的合成有較大的影響，較低濃度的草酸能刺激細(xì)胞的生長，較高濃度的草酸能促進(jìn)黃芪多糖的合成，而苯丙氨酸和油酸的添加對黃芪細(xì)胞生長和黃芪多糖合成的影響結(jié)果相一致，均表現(xiàn)輕微刺激細(xì)胞生長和顯著促進(jìn)黃芪多糖的合成，但二者最佳作用濃度不同。由此可以推斷，前體促進(jìn)細(xì)胞生長和次級代謝產(chǎn)物積累的作用機(jī)制可能不同，且前體的用量也是影響了次級代謝產(chǎn)物的合成的重要因素。

在植物細(xì)胞的次生代謝中，苯丙氨酸是一個代謝中間體，是生物堿、木質(zhì)素、黃酮等多種次生代謝物質(zhì)的生物合成的前體，同時在植物體內(nèi)可以作為碳源和氮源，并通過參與蛋白質(zhì)的生物合成來影響細(xì)胞生長^[8-9]，因此苯丙氨酸被廣泛用作前體物質(zhì)附加在植物懸浮培養(yǎng)液中促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成。Mizukami等早在1977年就發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸可以促進(jìn)紫草細(xì)胞萘醌類化合物的合成^[10]。魏欣方等研究表明一定濃度的苯丙氨酸能促進(jìn)紅景天苷的產(chǎn)量^[11]。梁曉芳等進(jìn)行大豆下胚軸懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系時，附加了一定濃度的苯丙氨酸，結(jié)果不僅顯著提升了懸浮細(xì)胞中大豆素的積累，同時還有效促進(jìn)了染料木素的含量^[12]。植物中草酸長期被認(rèn)為是一種沒有生理意義的代謝副產(chǎn)物，其對懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長和次生代謝物合成的影響也未見報道。但越來越多的研究表明，草酸可以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞Ca2+濃度，在植物適應(yīng)環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要功能^[13-15]。Ca2+是一個重要的第二信使^[16]，能誘導(dǎo)處理能促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物的合成，如周倩耘等分析指出CaCl₂在較低的濃度下明顯促進(jìn)人參單體皂苷和總皂苷的積累，還能促進(jìn)人參皂苷的分泌^[17]。在該試驗(yàn)中較高濃度的草酸促進(jìn)了黃芪多糖的積累，抑制了細(xì)胞生長。邢更妹在研究黃芪組織培養(yǎng)產(chǎn)生多糖的代謝途徑時指出脂肪酸是多糖合成的前體物之一，向黃芪愈傷組織培養(yǎng)體系添加前體物質(zhì)油酸，黃芪多糖的含量明顯增多^[18]。因此該試驗(yàn)選擇了油酸為前體進(jìn)行追加，結(jié)果表明較高濃度的油酸能最大幅度提高黃芪多糖的含量。

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中次生代謝物的產(chǎn)量通常較低，目前，提高植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中次生代謝物產(chǎn)量的方法主要有前體飼喂、添加誘導(dǎo)子、兩相培養(yǎng)、培養(yǎng)條件控制和高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選等^[19]。許多研究表明2種或多種條件聯(lián)合應(yīng)用會對次生代謝產(chǎn)物的提高起到協(xié)同作用，如前體物質(zhì)、誘導(dǎo)子和光照聯(lián)合使用對葡萄細(xì)胞花青素含量有顯著影響^[20]。該研究雖然成功地利用前體追加的方法提高了黃芪多糖的含量，但對于前體物質(zhì)的最佳添加時間、對前體物質(zhì)利用率高的細(xì)胞系篩選和多種促進(jìn)因子聯(lián)合作用等還有待進(jìn)一步試驗(yàn)，從而篩選出有利于黃芪懸浮細(xì)胞中黃芪多糖積累的有效方法，為黃芪細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

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