周俊立　葉小華　鄒志輝等

摘要：目的 研究香鱗毛蕨醇提取物對(duì)紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶的抑制作用， 初步探討其抗真菌作用機(jī)制。方法 采用ELISA測(cè)定角鯊烯環(huán)氧化酶活性，還原糖法測(cè)定β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性。結(jié)果 香鱗毛蕨提取物不同濃度組均能降低紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），隨香鱗毛蕨提取物濃度增加，紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性逐漸降低，香鱗毛蕨提取物中濃度組和高濃度組能降低β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002，P=0.000）。結(jié)論 香鱗毛蕨提取物抗真菌作用機(jī)制可能和角鯊烯環(huán)氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性受到抑制有關(guān)。

關(guān)鍵詞：香鱗毛蕨提取物；紅色毛癬菌；角鯊烯環(huán)氧化酶；β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶

紅色毛癬菌T. rubrum 是臨床常見(jiàn)的皮膚癬菌， 也是淺部真菌病的主要病原菌，是一種在世界范圍內(nèi)廣泛傳播的病原真菌， 它能引起各種淺表感染， 如頭癬、體癬、股癬、手癬、足癬以及甲癬。紅色毛癬菌是一種專(zhuān)性致病菌，一旦感染紅色毛癬菌則很難根治，在停用抗真菌藥物后會(huì)經(jīng)常復(fù)發(fā)[1]。

香鱗毛蕨（Dryopteris fragrans L.）為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，生長(zhǎng)于海拔1000～1700m的山坡或巖石縫中，用于治療真菌感染的手足癬、體股癬等，療效甚佳，不易復(fù)發(fā)[2]。為了探討香鱗毛蕨提取物抗皮膚癬菌的作用機(jī)制， 本實(shí)驗(yàn)研究了香鱗毛蕨提取物對(duì)紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶活性和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶的影響， 為研究香鱗毛蕨抗真菌作用原理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1藥物 供試藥材本實(shí)驗(yàn)研究所用的香鱗毛蕨采集于黑龍江省，經(jīng)鑒定為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物香鱗毛蕨，香鱗毛蕨提取物采用70% 醇提液，用二甲基亞砜（DMSO）配制成含生藥濃度為625mg/ml的儲(chǔ)存液， 存于-70℃冰箱備用。

1.2菌株 紅色毛癬菌購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病防治研究所菌種保藏中心。

1.3 主要試劑 真菌角鯊烯環(huán)氧化酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒；真菌細(xì)胞β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性定量檢測(cè)試劑盒， 美國(guó)GENMED SCIENTIFICS INC 產(chǎn)品。

1.4主要儀器 生化培養(yǎng)箱（Forma 3111）， 美國(guó)賽默飛世爾科技產(chǎn)品；生物安全柜（Thermo Forma 1389），美國(guó)賽默飛世爾科技產(chǎn)品；高速低溫離心機(jī)， 德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀（Bio-Rad X mark）， 美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；熒光光度計(jì)（Thermo Scientific Lumina）， 美國(guó)賽默飛世爾科技產(chǎn)品。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組 分空白生長(zhǎng)對(duì)照組和香鱗毛蕨提取物低、中、高濃度組（香鱗毛蕨70% 醇提液含生藥濃度由低向高依次為62.5，125，250mg/ml）。實(shí)驗(yàn)方法參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）藥物敏感性試驗(yàn)方案， 將不同濃度的香鱗毛蕨提取物和紅色毛癬菌在25℃孵育7d，然后收集培養(yǎng)物菌絲樣品用于酶活性測(cè)定。

2.2 ELISA測(cè)定角鯊烯環(huán)氧化酶活性 收集紅色毛癬菌（空白對(duì)照組和香鱗毛蕨提取物低、中、高濃度組）培養(yǎng)液， 1000 g離心10 min，分離紅色毛癬菌培養(yǎng)物菌絲，用pH 7. 0的PBS緩沖溶液漂洗3次，1000 g離心10 min，上清棄掉。每組稱(chēng)取培養(yǎng)物菌絲樣品0.3g，加1 ml PBS緩沖溶液（pH 7. 0），超聲破碎細(xì)胞，-20℃放置過(guò)夜，第2d反復(fù)凍融3次，然后5000g 離心5min，吸取上清，酶活性測(cè)定按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算其酶活性平均值。

2.3β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用還原糖測(cè)定法（分光光度法）進(jìn)行β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性測(cè)定。收集5 ml真菌細(xì)胞培養(yǎng)液，裂解后按試劑盒說(shuō)明說(shuō)進(jìn)行操作。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算其酶活性平均值。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理軟件，不同濃度組對(duì)酶活性的影響采用單因素方差（ANOVA）分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1不同濃度香鱗毛蕨提取物對(duì)紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶活性的影響 ANOVA分析，不同濃度組香鱗毛蕨提取物處理后紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.403，P=0.000），表1結(jié)果表明，香鱗毛蕨提取物不同濃度組均能降低紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性（差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05），不同濃度組香鱗毛蕨提取物對(duì)紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶活性的影響兩兩比較差值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且圖1結(jié)果顯示隨香鱗毛蕨提取物濃度增加，紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性逐漸降低，香鱗毛蕨提取物高濃度組紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性最低。

3.2不同濃度香鱗毛蕨提取物對(duì)紅色毛癬菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性 ANOVA分析，不同濃度組香鱗毛蕨提取物處理后紅色毛癬菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.521，p=0.001），不同濃度組香鱗毛蕨提取物對(duì)紅色毛癬菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性的影響兩兩比較結(jié)果表明（表2），和對(duì)照組相比，香鱗毛蕨提取物低濃度組紅色毛癬菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.200），中濃度組和高濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002，P=0.000）。

4 討論

香鱗毛蕨是一種重要的藥用植物，有研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨具有顯著的抗皮膚癬菌作用，逐漸地被人們重視[2]，但其抗真菌作用機(jī)制目前還不太明確。

麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分，在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞活力以及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾饔肹3]。目前臨床最常用的抗真菌藥物主要有兩性霉素B、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和特比萘芬， 它們都是針對(duì)真菌細(xì)胞膜上的特有脂質(zhì)麥角甾醇來(lái)發(fā)揮其抗真菌作用的[4]。角鯊烯環(huán)氧化酶是真菌細(xì)胞膜麥角甾醇生物合成通路中的一個(gè)重要酶， 它能使角鯊烯轉(zhuǎn)變成羊毛甾醇。角鯊烯環(huán)氧化酶如受到抑制， 將導(dǎo)致真菌重要膜成分麥角甾醇生物合成受到抑制，真菌細(xì)胞發(fā)生損傷或死亡[5]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，香鱗毛蕨提取物不同濃度組均能降低紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性（差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05），隨香鱗毛蕨提取物濃度增加，紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性逐漸降低，香鱗毛蕨提取物濃度高濃度組紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性最低。提示香鱗毛蕨抗真菌機(jī)制可能是通過(guò)抑制角鯊烯環(huán)氧化酶的活性， 從而影響真菌細(xì)胞膜重要成分麥角甾醇的生物合成有一定的關(guān)系。

葡聚糖是細(xì)胞壁的主要成分， 占細(xì)胞干重的48% ～ 60%，β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性如受到抑制，就可致真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞， 細(xì)胞破裂死亡[6]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示香鱗毛蕨提取物可能對(duì)β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性有抑制作用，提示香鱗毛蕨提取物可能通過(guò)相應(yīng)途徑破壞真菌細(xì)胞壁起抗真菌作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究香鱗毛蕨不同濃度的提取物對(duì)紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性的影響，結(jié)果提示香鱗毛蕨抗真菌機(jī)制可能是通過(guò)抑制角鯊烯環(huán)氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶的活性， 影響真菌細(xì)胞膜重要成分麥角甾醇的生物合成有一定的關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cotta SR， da Mota FF， Tupinambá G， et al. Antimicrobial activity of Paenibacillus kribbensis POC 115 against the dermatophyte Trichophyton rubrum[J].World J Microbiol Biotechnol，2012，28（3）.

[2]沈志濱，金哲雄，張德連，等.香鱗毛蕨的生藥學(xué)研究[J].中草藥，2002，33（7）：661-663.

[3]古力娜.達(dá)吾提，斯拉甫.艾白，李治建，等.氣-質(zhì)聯(lián)用研究地錦草提取物對(duì)紅色毛癬菌麥角甾醇的影響[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（12）.

[4]葉麗娟，王輅，朱輝.抗真菌藥物作用機(jī)制及真菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，2006，27（5）：221-227.

[5]趙明月，李治建，古力娜·達(dá)吾提， 等.地錦草有效部位對(duì)紅色毛癬菌羊毛甾醇生物合成的影響[J].中藥藥理與臨床，2012，28（ 3）：142-144.

[6]張影，王東，李興從，等.抗病原真菌藥物的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2011，23：983-991.編輯/劉小燕