李遜 李巍偉 陳明媚等

摘要：目的 探討125I粒子連續(xù)體外照射聯(lián)合表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）抑制劑（C225）對(duì)人胃癌細(xì)胞（MNK-45）的促凋亡作用及對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax表達(dá)的影響，初步了解二者聯(lián)合治療胃癌的相關(guān)機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)共分對(duì)照組、單藥組、單照組、聯(lián)合組。單藥組與聯(lián)合組細(xì)胞預(yù)先經(jīng)2000μg/ml C225處理。選取放射活度14.49MBq的125I粒子建立體外照射裝置，對(duì)單照組和聯(lián)合組細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)照射，對(duì)照組與單藥組細(xì)胞則置于相同裝置中但未接受125I粒子照射。72h后收集各組細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察分析細(xì)胞生長(zhǎng)情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2和BaxmRNA的表達(dá)。 結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖均較對(duì)照組明顯受抑，倍增時(shí)間延長(zhǎng)，差異均有顯著性（P<0.05）。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加，差異均有顯著性（P<0.05），且聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率較單照組與單藥組均明顯增加，差異有顯著性（P<0.05）。RT-PCR檢測(cè)顯示各實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組均有不同程度的Bax表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)減弱以及Bax/Bcl-2比值增加，差異有顯著性（P<0.05），且分別與單藥組和單照組比較，聯(lián)合組細(xì)胞上述表現(xiàn)最為明顯（P<0.05）。結(jié)論 125I粒子體外照射聯(lián)合C225可顯著強(qiáng)化對(duì)人胃癌細(xì)胞MNK-45的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)；其機(jī)制可能與二者協(xié)同下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax表達(dá)，進(jìn)一步提高Bax/Bcl-2比值有關(guān)。

關(guān)鍵詞：125I粒子；表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑；人胃癌細(xì)胞；凋亡；Bcl-2；Bax

125I粒子永久組織間植入作為一種微創(chuàng)放射治療手段，目前已被廣泛運(yùn)用于不同分期及病理類型胃癌的臨床治療并獲得良好效果[1-3]。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）因其明確的惡性生物學(xué)特性而成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。EGFR抑制劑西妥昔單抗（C225）為近年來研發(fā)的一種針對(duì)EGFR的高效分子靶向藥物，現(xiàn)已被用于多種腫瘤的臨床輔助治療。本實(shí)驗(yàn)通過125I粒子外照射聯(lián)合C225作用于人胃癌細(xì)胞MNK-45，觀察其對(duì)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，并對(duì)Bcl-2及Bax表達(dá)情況進(jìn)行量化分析，旨在初步探討二者聯(lián)合的抗胃癌機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1試劑與儀器 注射用C225（100mg/50ml/瓶））由德國(guó)Boehringer公司生產(chǎn)；人胃癌細(xì)胞株MNK-45（EGFR高表達(dá)系）購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；125I粒子（放射性活度14.49MBq）購自上海欣科醫(yī)藥公司；高糖型（DMEM）培養(yǎng)液為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；青鏈雙抗為Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清購為烏拉圭GIBCO公司產(chǎn)品；β肌動(dòng)蛋白（β-actin）、 （Bcl-2）和（Bax）基因PCR引物均由由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，基因片段擴(kuò)增的引物序列見表1。（ABI）實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀購自美國(guó) ABI公司。流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BECKMAN COULTER公司，顯微拍攝系統(tǒng)為日本NIKON公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及標(biāo)本制作 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)MNK-45細(xì)胞，將其置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～3d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以3×106/ml的濃度接種于直徑為35mm的培養(yǎng)皿中，共接種16個(gè)皿，每皿約有3ml細(xì)胞懸液。24h后（待細(xì)胞貼壁、穩(wěn)定）用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2建立外放射模型 根據(jù)曼徹斯特系統(tǒng)布源原理，將放射活度為14.49MBq型125I粒子9粒，依據(jù)Meredith設(shè)計(jì)的近距離照射治療體外細(xì)胞試驗(yàn)布源系統(tǒng)制作模型（圖1）。根據(jù)美國(guó)醫(yī)用物理學(xué)家協(xié)會(huì)（AAPM） 發(fā)布的放射劑量計(jì)算公式得出該125I粒子外放射模型72h放射總劑量約為113cGy。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分四組，對(duì)照組、單照組、單藥組、聯(lián)合組。每組4個(gè)培養(yǎng)皿，單藥組與聯(lián)合組預(yù)先加入2000μg/ml C225約0.35ml，使培養(yǎng)皿內(nèi)C225濃度達(dá)到約200μg/ml（參考C225穩(wěn)態(tài)血藥濃度均值）。對(duì)照組和單照組則加入等量培養(yǎng)基。將四組細(xì)胞置入照射模型，其中單照組與聯(lián)合組接受125I粒子照射，對(duì)照組與單藥組則不接受照射，72h后收集細(xì)胞。

1.2.4細(xì)胞增殖檢測(cè) 72h后，取對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以培養(yǎng)皿單位細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞數(shù)/ml）為縱坐標(biāo)，觀察時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。根據(jù)Patterson公式計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間（doubling time，TD）：TD=T×log2/（logNt-logN0），其中N0為初始細(xì)胞數(shù)，Nt為終末細(xì)胞數(shù)，T為Nt～N0的時(shí)間。然后進(jìn)行對(duì)比和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5常規(guī)流式細(xì)胞法（FCM）碘化丙啶（PI）染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取培養(yǎng)皿細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，以磷酸鹽緩沖液洗滌，0.25%胰酶消化，PBS緩沖液吹打收集制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，2000r/min離心、重懸，去上清液；沉淀物PBS洗滌2次，加入DNA-PREP試劑盒中的核糖核酸酶200μl，避光保存15min，然后加入PI 1000μl，避光保存15min，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6半定量RT-PCR檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá) 內(nèi)參β-actin上游引物為5'-AAGGCCAACCGCGAGAA-3'，下游引物為5'- CCTCGTAGATGGGCACA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為176bp；Bax上游引物為5'-GGATGATTGCCGCCGT-3'，下游引物為5'-CCCAGTTGAAGTTGCCGT-3'，擴(kuò)為增片段長(zhǎng)度92bp：Bcl-2上游引物為5'-ACAGAGAACCATCCCTATT-3'，下游引物為5'-GAGAGAATGTTGGCGTCTT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為321bp。TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，每個(gè)樣本等量取總RNA5μg，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃3 rnin，此后變性90℃45s，退火57℃45s，延伸72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)。結(jié)果分析：產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠圖像處理系統(tǒng)得出目的基因及內(nèi)參灰度值，以內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比進(jìn)行半定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)資料采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同處理對(duì)細(xì)胞增殖的影響72h后，各組細(xì)胞數(shù)量分別為對(duì)照組（15.74±0.67）×106/ml、單放組（6.27±0.91）×106/ml、單藥組（8.27±1.06）×106/ml、聯(lián)合組（4.57±0.29）×106/ml。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)總體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；各組細(xì)胞生長(zhǎng)倍增時(shí)間分別為對(duì)照組（0.76±0.12）、單照組（1.92±0.43）、單藥組（1.68±0.21）、聯(lián)合組（2.47±0.19），各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)，較對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)倍增時(shí)間總體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2不同處理對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 檢測(cè)結(jié)果顯示各處理組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率均明顯高于單照組與單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3不同處理組中細(xì)胞Bax 和Bcl-2的表達(dá)變化 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均較對(duì)照組出現(xiàn)Bax mRNA表達(dá)增加，Bcl-2mRNA表達(dá)減弱以及Bax/Bcl-2比值提高（P<0.05）。此效應(yīng)在聯(lián)合組表現(xiàn)尤為顯著，明顯強(qiáng)于單照組與單藥組（P<0.05），見表3。

3 討論

125I粒子為一種低劑量率的微型放射源，在衰變過程中可同時(shí)釋放X線和γ射線，臨床上可將其以不同方式植入腫瘤組織、瘤旁組織、淋巴轉(zhuǎn)移途徑等部位以治療不同分期的各類惡性腫瘤，能夠在較長(zhǎng)的半衰期內(nèi)（60.1d）對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)殺傷，相比于傳統(tǒng)體外放射治療，125I粒子具有精度高，創(chuàng)傷小，射線殺傷半徑適當(dāng)?shù)葍?yōu)點(diǎn)[4]。已知的研究結(jié)果表明，低劑量率輻射引發(fā)腫瘤細(xì)胞損傷可導(dǎo)致其出現(xiàn)兩種死亡形式，即壞死性死亡及凋亡，其中凋亡占主導(dǎo)地位[5]。何啟明等[6]報(bào)道，胃癌細(xì)胞經(jīng)125I粒子照射后出現(xiàn)大量凋亡，且Bcl-2與Bax的表達(dá)均有所改變，Bcl-2/Bax比值降低，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符，因此認(rèn)為通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)誘導(dǎo)凋亡是125I粒子抗腫瘤的重要作用機(jī)制。

EGFR是一種廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上的跨膜多功能糖蛋白，在多數(shù)上皮源性腫瘤中呈過度表達(dá)與活化狀態(tài)。它通過與相應(yīng)配體包括表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子等結(jié)合后發(fā)生自體磷酸化而被激活，進(jìn)而激發(fā)細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂、遷徙以及腫瘤新生血管的形成[7]。此外，癌細(xì)胞在接受高強(qiáng)度射線刺激后，會(huì)出現(xiàn)EGFR反應(yīng)性再表達(dá)，直接致使照射后殘存癌細(xì)胞放射抗拒的提升，一方面導(dǎo)致后續(xù)輻射治療效果減弱，另一方面使得殘存癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與增殖能力增強(qiáng)。因此，通過阻滯和下調(diào)EGFR抑制腫瘤細(xì)胞的無序生長(zhǎng)以及改善放療預(yù)后是很有價(jià)值的策略。C225對(duì)于EGFR高表達(dá)的結(jié)直腸癌、頭頸癌、非小細(xì)胞肺癌均有較為明確的療效。

Bcl-2是目前備受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，共分為兩大類，一類是抑制凋亡基因如Bcl-2，另一類是促進(jìn)凋亡基因，如Bax。特殊情況下細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax的相對(duì)固定比例被打破，細(xì)胞凋亡程度即受到改變。若Bax表達(dá)占優(yōu)勢(shì)，則Bcl-2被抑制，凋亡被誘導(dǎo)；反之若Bax表達(dá)受抑制，則細(xì)胞得以存活。

基于上述理論，筆者認(rèn)為125I粒子低劑量率持續(xù)照射同時(shí)聯(lián)合C225阻斷EGFR可更有效地發(fā)揮抗胃癌作用。一方面，持續(xù)照射在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保證了與C225的協(xié)同作用，避免了普通外放射與該藥聯(lián)用時(shí)的給藥時(shí)機(jī)問題；另一方面，C225單獨(dú)作用的同時(shí)降低腫瘤細(xì)胞的輻射抗性，提高了粒子照射的治療效率。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一觀點(diǎn)，細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組MNK-45細(xì)胞較對(duì)照組均出現(xiàn)明顯生長(zhǎng)緩慢及凋亡率增加的現(xiàn)象，其中又以聯(lián)合作用組此效應(yīng)體現(xiàn)得最為顯著。值得一提的是，聯(lián)合作用時(shí)引起的細(xì)胞凋亡率大于單純照射與單純藥物所引起的凋亡率之和。說明不但C225本身可以引起MNK-45細(xì)胞的凋亡，而且促進(jìn)了125I粒子照射下MNK-45細(xì)胞凋亡 。

由上可見，臨床上行125I粒子植入治療胃癌時(shí)，可以考慮與C225聯(lián)合應(yīng)用，以增強(qiáng)治療效果。但目前關(guān)于二者聯(lián)合時(shí)對(duì)正常組織的毒性機(jī)制以及細(xì)胞敏感性預(yù)測(cè)因子的相關(guān)研究尚缺乏，故使用仍需慎重。因此，該療法的臨床應(yīng)用意義仍需在動(dòng)物試驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。

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