鄧治 杜磊 李德軍

摘 要 本研究根據(jù)HbADF序列設(shè)計引物擴(kuò)增基因的編碼區(qū)，并將其插入到原核表達(dá)載體pET28a上，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-HbADF。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）宿主菌，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，獲得相對分子量為20 ku的融合蛋白。表達(dá)蛋白以可溶和包涵體兩種形式存在，通過親和層析方法純化可溶蛋白并獲得HbADF融合蛋白，用抗HIS標(biāo)簽的單抗對純化蛋白進(jìn)行了Western blot鑒定。該結(jié)果為進(jìn)一步研究HbADF蛋白特性及功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 肌動蛋白解聚因子；橡膠樹；原核表達(dá)；蛋白純化；Western blot

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

肌動蛋白是細(xì)胞骨架中微絲的重要組分，在細(xì)胞中以單體和多聚體兩種形式存在。單體肌動蛋白是由一條多肽鏈構(gòu)成的球形分子，又稱球狀肌動蛋白（G-actin）；肌動蛋白的多聚體形成肌動蛋白絲，稱為纖（絲）狀肌動蛋白（F-actin）。多個G-actin按照一定方式聚合形成F-actin，二者處于聚合與解聚的動態(tài)平衡過程中。這一獨(dú)特的動力學(xué)特性受一系列胞內(nèi)和胞外信號的調(diào)控，其中肌動蛋白結(jié)合蛋白起到重要作用。肌動蛋白結(jié)合蛋白控制著F-actin的裝配與拆卸，調(diào)節(jié)F-actin的長度、極性、穩(wěn)定性和三維結(jié)構(gòu)，并將F-actin與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的其它成分相連接，從而調(diào)節(jié)肌動蛋白的理化狀態(tài)，藉以完成多種細(xì)胞功能。迄今為止，已在植物中發(fā)現(xiàn)多種肌動蛋白結(jié)合蛋白，肌動蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor， ADF）是其中最重要的一種。ADF家族由113～168個氨基酸組成，成員之間的氨基酸序列同源性大約為54%～94%[1]。作為一個多基因家族，ADF在植物中存在很多異型體，如擬南芥中有11個ADF[2]，棉花中有8個ADF[3]，煙草中有2個ADF[4]。這些異型體通常在不同的組織中表達(dá)，并在解聚合肌動蛋白活性上存在差異。Mun等[5]將植物ADF分為營養(yǎng)型和生殖型2個亞群，營養(yǎng)型ADF主要在葉片、莖、根、花瓣和萼片中表達(dá)，生殖型ADF主要在花粉中表達(dá)[1]。ADF蛋白家族一方面能夠結(jié)合G-actin，使G-actin從肌動蛋白絲尖端解聚下來，另一方面能夠切斷F-actin，加速踏車行為，從而提高微絲的周轉(zhuǎn)率，在細(xì)胞骨架重構(gòu)和收縮調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過對肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，ADF家族成員參與許多重要生理過程，如細(xì)胞分化與生長[6]、胞質(zhì)分裂[7]、花粉管生長[8]、冷馴化[9]、信號傳導(dǎo)[10]等。鑒于ADF的重要作用，此類蛋白已成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)。

乳管傷口堵塞物的形成可使橡膠樹排膠速度減慢，最終導(dǎo)致膠乳停排[11]。Hao等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)割膠后乳管傷口末端形成的蛋白質(zhì)網(wǎng)是堵塞物的主要組分，隨后高政權(quán)等[14]研究發(fā)現(xiàn)乳管傷口處蛋白質(zhì)網(wǎng)的形成與肌動蛋白絲的聚集同時發(fā)生。據(jù)此，高政權(quán)和郝秉中[15]認(rèn)為肌動蛋白細(xì)胞骨架可能在蛋白質(zhì)網(wǎng)的形成過程中起著重要作用，從而參與乳管傷口的堵塞。作為肌動蛋白結(jié)合蛋白重要成員的橡膠樹ADF可能通過調(diào)節(jié)肌動蛋白解聚和聚合來控制肌動蛋白細(xì)胞骨架的動態(tài)裝配過程，藉此在乳管的堵塞過程中發(fā)揮作用。本研究以橡膠樹膠乳HbADF開放閱讀框構(gòu)建原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中成功表達(dá)，純化并鑒定了HbADF融合蛋白，為后續(xù)HbADF抗體制備、蛋白特性及其在橡膠樹乳管堵塞中的作用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pET28a及大腸桿菌BL21（DE3）為Novagen公司產(chǎn)品。大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。異丙基-β-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）購自Merck公司。Pyrobest DNA聚合酶和DNA Marker購自TaKaRa公司。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit和蛋白markers購自Fermentas公司。B-PER 6×His Fusion Protein Purification Kits 和ZebaTM Desalt Spin Columns購自Pierce公司?？笻IS標(biāo)簽鼠單克隆抗體和HRP-山羊抗鼠IgG購自北京康為世紀(jì)公司。引物合成和測序委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 pET28a-HbADF原核表達(dá)載體的構(gòu)建 橡膠樹膠乳HbADF基因的（GenBank登錄號為HM126477）開放閱讀框?yàn)?20 bp，編碼139個氨基酸，理論分子量為16.1 ku[16]。本文根據(jù)HbADF基因序列和pET28a載體多克隆位點(diǎn)設(shè)計1對引物，擴(kuò)增HbADF開放閱讀框。上游引物為pET28a-HbADFF： 5′-GGATCCATGGCCAATGCTGCTTCTGG

-3′，下游引物為pET28a-HbADFR： 5′-GTCGACGT

CAGCTGGCACGGCTTTTAAAG-3′。以橡膠樹膠乳cDNA為模板，PCR擴(kuò)增條件為： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接到pMD18-T載體，挑取陽性克隆送公司測序。將測序正確的陽性克隆搖菌提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切并回收擴(kuò)增產(chǎn)物，與同樣經(jīng)過酶切并回收的原核表達(dá)載體pET28a通過T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中。在含100 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定，挑取陽性克隆送公司測序。

1.2.2 pET28a-HbADF的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆于含有100 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB液體培養(yǎng)基37 ℃中培養(yǎng)過夜。按1 ∶ 100比例取菌液至含有100 μg/mL卡那霉素（Kan）的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4左右，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2、4、6 h，收集菌體。用0.1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）洗滌沉淀2次后重懸菌體，加入等體積的2×上樣緩沖液，95 ℃煮10 min使蛋白變性，12 000 g/min離心5 min，取10 μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。收集誘導(dǎo)表達(dá)4 h時的菌體，冰上用30%超聲強(qiáng)度破碎3 s，間隔3 s處理樣品10 min。4 ℃，12 000 g/min 離心10 min，分離上清和沉淀。取全菌、超聲波處理后的上清和沉淀樣品各10 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.3 融合蛋白pET28a-HbADF的純化及鑒定 融合蛋白純化按照B-PERR6×His Fusion Protein Spin Purification Kits 說明書進(jìn)行，步驟略有改動。其中洗滌條件改進(jìn)為用含50 mmol/L咪唑的Washing Buffer洗5次，含75 mmol/L咪唑的Washing Buffer洗2次，含100 mmol/L咪唑的Washing Buffer洗2次，含150 mmol/L咪唑的Washing Buffer洗1次，最后用200 mmol/L咪唑的Elution Buffer進(jìn)行洗脫。采用ZebaTM Desalt Spin Columns對純化后的融合蛋白進(jìn)行緩沖液置換。以未誘導(dǎo)的重組表達(dá)載體及空載體作為對照。

1.2.4 Western雜交鑒定 將純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用TBST洗膜3次，接著把膜放入5%的BSA中4 ℃封閉過夜。用TBST洗膜3次，將膜在1 ∶ 500稀釋的一抗中孵育2 h。再洗膜3次，放入按1 ∶ 2 000稀釋的二抗中孵育1.5 h。顯色后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-HbADF原核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

以橡膠樹膠乳cDNA為模板，擴(kuò)增出一條大小約為430 bp（含添加的酶切位點(diǎn)）左右的條帶，回收該條帶，與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆測序。提取測序正確的陽性克隆質(zhì)粒，利用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，回收目的條帶，進(jìn)一步與經(jīng)同樣雙酶切并回收的pET28a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)生約為420 bp左右的目的條帶（圖1），表明HbADF編碼區(qū)已插入到表達(dá)載體pET28a中。進(jìn)一步將陽性克隆測序，結(jié)果表明HbADF開放閱讀框未出現(xiàn)堿基突變及移碼現(xiàn)象。說明HbADF原核表達(dá)載體構(gòu)建正確。將重組質(zhì)粒命名為pET28a-HbADF。

2.2 pET28a-HbADF融合蛋白的表達(dá)

重組質(zhì)粒pET28a-HbADF轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）中，挑取單克隆菌落進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)的pET28a-HbADF產(chǎn)物中比對照多出了1條約20 ku左右的蛋白條帶（圖2），大小與預(yù)期pET28a-HbADF融合表達(dá)產(chǎn)物基本一致。而未誘導(dǎo)的pET28a和pET28a-HbADF及誘導(dǎo)條件下的pET28a產(chǎn)物中均未見該蛋白條帶，說明pET28a-HbADF在大腸桿菌中融合表達(dá)。由圖2中第4、5和6泳道可見誘導(dǎo)時間對pET28a-HbADF融合蛋白的表達(dá)量幾乎沒有影響。

將誘導(dǎo)表達(dá)4 h的產(chǎn)物超聲波破碎后離心，分別收集細(xì)菌沉淀和裂解上清，進(jìn)行電泳檢測。由圖3中第2和3泳道可見，表達(dá)產(chǎn)物一部分以可溶性形式存在于上清中，另一部分則以不溶性的包涵體形式存在于沉淀中。

2.3 pET28a-HbADF融合蛋白的純化及鑒定

由圖4可知，純化后的蛋白產(chǎn)物中僅在20 ku左右出現(xiàn)單一條帶，經(jīng)Bradford法測定純化后的融合蛋白濃度約為0.26 mg/mL。通過ZebaTMDesalt Spin Columns將融合蛋白置換溶解于ddH2O中，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 pET28a-HbADF融合蛋白的鑒定

Western blot結(jié)果表明抗HIS標(biāo)簽鼠單克隆抗體可以和純化后的pET28a-HbADF融合蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，且與預(yù)期大小20 ku左右相一致（圖5），說明純化的融合蛋白是帶有HIS標(biāo)簽的HbADF蛋白，可作為抗原用于后續(xù)抗體制備及蛋白功能研究。

3 討論

目前對植物ADF的研究多集中在基因水平方面，蛋白水平方面的研究相對較少。Chen等[17]利用原核表達(dá)的NtADF蛋白來研究pH值和磷酸化對ADF的調(diào)控機(jī)制。Augustine等[18]制備了小立碗蘚ADF的抗體，通過Western blot發(fā)現(xiàn)Ser 6磷酸化對ADF的功能發(fā)揮起到至關(guān)重要的作用。由此可見制備ADF蛋白對于深入研究ADF的功能和調(diào)控機(jī)制尤為必要。本課題組克隆了橡膠樹膠乳ADF基因，但對其功能及調(diào)控機(jī)制還不清楚。因此，本研究根據(jù)已知HbADF序列，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-HbADF，通過原核表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)了1個約為20 ku的HbADF融合蛋白?？扇苄苑治鼋Y(jié)果表明該融合蛋白為部分可溶，通過His標(biāo)簽親和層析純化了融合ADF蛋白，該蛋白能與抗His標(biāo)簽的單抗發(fā)生特異性反應(yīng)，說明本研究表達(dá)和純化的融合蛋白的確為帶HIS標(biāo)簽的HbADF。研究結(jié)果為下一步HbADF抗體制備、蛋白表達(dá)模式分析、蛋白特性和調(diào)控、以及ADF對肌動蛋白的調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

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