趙文斌 李婭 趙川等

[摘要]目的：觀察傣藥咪多領(lǐng)（云南琵琶甲）提取物制劑對(duì)兔耳增生性瘢痕組織的影響。方法：建立兔耳增生性瘢痕動(dòng)物模型，術(shù)后28天將模型隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性藥物（康瑞保）對(duì)照組和空白對(duì)照組，分別外用琵琶甲制劑、康瑞保或生理鹽水，4周后觀察各組瘢痕形態(tài)、瘢痕增生指數(shù)（HI）、成纖維細(xì)胞數(shù)量、膠原密度及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組、康瑞保對(duì)照組瘢痕增生指數(shù)（HI）均較空白對(duì)照組低，差異有顯著性意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組、康瑞保對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)量和膠原密度與空白對(duì)照組比較均減少或降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組、康瑞保對(duì)照組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1表達(dá)與空白對(duì)照組比較均減少（P<0.05）。結(jié)論：傣藥咪多領(lǐng)（云南琵琶甲）可抑制兔耳瘢痕增生。

[關(guān)鍵詞]琵琶甲；增生性瘢痕；動(dòng)物模型

[中途分類(lèi)號(hào)]R62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2014）19-1611-04

皮膚受到創(chuàng)傷、炎癥刺激后，組織內(nèi)有過(guò)量的成纖維細(xì)胞增殖和膠原沉積，以致失去正常皮膚的形態(tài)而形成瘢痕。目前，瘢痕的防治仍然是臨床上的難題之一。本研究利用兔耳增生性瘢痕模型觀察傣藥咪多領(lǐng)（云南琵琶甲）制劑對(duì)瘢痕組織的作用，為該藥防治瘢痕提供初步理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物：云南琵琶甲提取物制劑由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供，采用甲醇熱回流并正己烷萃取的方法制備，濃度為0.3g/ml生藥。康瑞保（復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠），由德國(guó)麥?zhǔn)洗笏帍S提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及器材：成年健康大耳白兔12只，體重2.5～3.0kg，雌雄各半。由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)48h后實(shí)驗(yàn)。自動(dòng)石蠟包埋機(jī)（Leitz公司，德國(guó)），全自動(dòng)脫水機(jī)（Sakura公司，日本），石蠟切片機(jī)（Leitz公司，德國(guó)），光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus公司，日本），電熱恒溫烤箱（上海醫(yī)療設(shè)備廠）等。TGF-β1一抗、SABC試劑盒（武漢博士德公司），通用型SP檢測(cè)試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1建立動(dòng)物模型：先用氯胺酮20mg/kg進(jìn)行兔背肌注，麻醉成功后碘伏液消毒兔耳皮膚。然后在兔雙側(cè)耳腹側(cè)分別做6個(gè)直徑為lcm、間距2cm的園形創(chuàng)面，完整切除全層皮膚，直至軟骨膜表面，并完整切除軟骨膜。無(wú)菌紗布?jí)浩戎寡笸坎良t霉素眼膏，創(chuàng)面暴露。

1.3.2動(dòng)物模型分組、給藥及處理：創(chuàng)面上皮化后（術(shù)后28天）將12只兔的144個(gè)創(chuàng)面隨機(jī)分為3組，即琵琶甲提取物制劑實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性藥物（康瑞保）對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組共有48個(gè)創(chuàng)面。實(shí)驗(yàn)組、康瑞保對(duì)照組從術(shù)后28天開(kāi)始給藥，分別于瘢痕局部外涂云南琵琶甲提取物、康瑞保，每次0.5ml/瘢痕，涂藥后用敷料封包，使藥物充分發(fā)揮作用，空白對(duì)照組外涂生理鹽水，3次/天。給藥4周后在同樣麻醉下切取瘢痕組織標(biāo)本，切片觀察。組織學(xué)觀察：標(biāo)本用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛緩釋液固定，脫水，石蠟固定包埋，切片，厚度5μm，切片后蘇木精-伊紅染色，在顯微鏡下觀察。免疫組織化學(xué)觀察：瘢痕組織石蠟包埋、切片，厚度4μm，二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，檸檬酸緩沖液中高壓修復(fù)抗原，5%山羊血清封閉20min ，加入1：100倍稀釋TGF-β1一抗，4℃過(guò)夜，再滴加生物素化二抗37℃孵育20min，SABC工作液37℃處理20min，DAB溶液顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇溶液分化，飽和碳酸鋰溶液返蘭，脫水透明后封片觀察。

1.4觀察指標(biāo)：①大體觀察：在給藥前（術(shù)后28天）、給藥4周后（術(shù)后56天），分別記錄兔耳瘢痕大小、顏色、質(zhì)地及瘢痕厚度；②瘢痕增生指數(shù)（HI）：HE染色組織切片于低倍鏡下用測(cè)微尺測(cè)量，按公式m=A/B計(jì)算瘢痕增生指數(shù)。A=瘢痕凸起最高點(diǎn)至耳軟骨表面的垂直高度；B=瘢痕周邊正常皮膚皮緣至耳軟骨表面的垂直高度；③每張組織切片分別隨機(jī)選5個(gè)不重疊視野進(jìn)行圖像觀察，定量檢測(cè)成纖維細(xì)胞數(shù)量和膠原密度；④轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1檢測(cè)：給藥4周，切取瘢痕組織，免疫組化法觀察各組標(biāo)本表達(dá)情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對(duì)指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1瘢痕形成情況：創(chuàng)面?zhèn)诩s7天后逐漸愈合，14～20天創(chuàng)面完全上皮化。給藥前（術(shù)后28天）見(jiàn)高出皮面的增生塊，淡紅色，觸之較軟。給藥4周后（術(shù)后56天）空白對(duì)照組增生塊較硬，充血明顯呈暗紅色，范圍不超過(guò)原創(chuàng)沿，厚度約為兔耳腹面皮膚厚度的3倍左右，多數(shù)瘢痕中心出現(xiàn)乳頭狀突起；實(shí)驗(yàn)組、康瑞保對(duì)照組瘢痕稍高出皮面，淡紅色，觸之較軟，有皺褶（如圖1）。

2.2 瘢痕增生指數(shù)情況：給藥4周實(shí)驗(yàn)組、康瑞保對(duì)照組和空白對(duì)照組HI分別為（2.10±0.32）、（2.01±0.29）和（3.31±0.45）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，治療組與康瑞保對(duì)照組之間HI差異無(wú)顯著性意義（P>0.05）；治療組、康瑞保對(duì)照組與空白對(duì)照組之間HI差異有顯著性意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.3組織切片觀察：給藥4周時(shí)，空白對(duì)照組真皮層明顯變厚，為周邊正常真皮層厚度的3～4倍，主要是大量成纖維細(xì)胞增殖，膠原纖維增多、增粗，致密并排列紊亂，其間有少量炎性細(xì)胞，結(jié)構(gòu)近似人的增生性瘢痕組織。治療組、康瑞保對(duì)照組真皮層厚度約為正常真皮層厚度的2倍，成纖維細(xì)胞數(shù)量較少，膠原纖維密度下降明顯，表層排列稍規(guī)則，成水平向，內(nèi)層排列紊亂（如圖2）。治療組、康瑞保對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)量和膠原密度與空白對(duì)照組比較均減少或降低，差異明顯（P<0.05），見(jiàn)表2。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果：TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒，主要表達(dá)在表皮的基底層細(xì)胞和真皮附屬器的上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和真皮深層的成纖維細(xì)胞胞漿及細(xì)胞表面。實(shí)驗(yàn)組、康瑞保對(duì)照組TGF-β1呈弱陽(yáng)性，空白對(duì)照組TGF-β1表達(dá)較強(qiáng)（如圖3）。實(shí)驗(yàn)組、康瑞保對(duì)照組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1表達(dá)與空白對(duì)照組比較均減少（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組與康瑞保對(duì)照組TGF-β1表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

皮膚創(chuàng)傷的愈合過(guò)程是以瘢痕形成的形式來(lái)完成的，瘢痕是創(chuàng)傷修復(fù)的必然產(chǎn)物，凡深達(dá)真皮層的傷口幾乎都以瘢痕愈合而告終[1]。瘢痕從病理學(xué)上可分為正常瘢痕和病理性瘢痕，以病理性瘢痕最多見(jiàn)，主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。病理性瘢痕是由皮膚纖維母細(xì)胞增殖及凋亡平衡失調(diào)所致的一種良性疾病[2]。瘢痕組織中基質(zhì)成分主要是膠原纖維，其中又以Ⅰ型膠原纖維居多。正常情況下，傷口內(nèi)的膠原合成與分解呈動(dòng)態(tài)平衡，在某些情況下，這種平衡被打破，導(dǎo)致成纖維、肌纖維母細(xì)胞合成膠原增多，而膠原纖維分解減少，膠原合成速度遠(yuǎn)大于膠原分解，最終導(dǎo)致了膠原沉積形成瘢痕組織。目前研究證實(shí)發(fā)生機(jī)制可能是由微循環(huán)、免疫、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和凋亡、膠原代謝和排列、細(xì)胞因子等多種因素共同作用的結(jié)果[3-4]。近年來(lái)，TGF-β被認(rèn)為與創(chuàng)傷愈合、瘢痕形成及多種纖維化性疾病關(guān)系最具代表性的細(xì)胞因子之一[5-6]。

目前，瘢痕的治療方法主要有手術(shù)切除、類(lèi)固醇激素、抗代謝藥、免疫抑制劑、放射療法和硅膠膜等[7]，外科手術(shù)的局部復(fù)發(fā)率高達(dá)80%[8]，在外科術(shù)后輔以加壓、激光治療等方法可降低局部復(fù)發(fā)率，但其復(fù)發(fā)率仍在50%以上[9]。放射治療是目前外科手術(shù)后降低瘢痕復(fù)發(fā)的有效方法，但其復(fù)發(fā)率大約在20%左右[10]。上述方法因易復(fù)發(fā)或嚴(yán)重的全身性副作用而限制了臨床應(yīng)用，因此從祖國(guó)中醫(yī)中藥及民族藥中篩選出療效確切、副作用小的防治瘢痕的有效藥物，具有重要的臨床意義。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)瘢痕的治療有著悠久的歷史，有關(guān)瘢痕的病機(jī)認(rèn)識(shí)，一般認(rèn)為本病與先天稟賦，素體特異有關(guān)，加之遭受金創(chuàng)，水火之傷，余毒未盡，氣滯血瘀，搏結(jié)經(jīng)絡(luò)而成[11]。治療上多采用活血化瘀、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛、酸澀收斂之品。喙尾琵琶甲（云南琵琶甲）是云南民間長(zhǎng)期使用的一種藥用昆蟲(chóng)，具有抗菌、消炎、解毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、提高抗病能力的作用，《西雙版納傣藥志》、《中華本草》傣藥卷記載，該蟲(chóng)傣藥名“咪多領(lǐng)”，功效為清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、消腫止痛、熄風(fēng)定驚，可內(nèi)服亦可外用。筆者在臨床試用該蟲(chóng)制劑治療增生性瘢痕收到較好的療效，用藥后瘢痕明顯萎縮變軟，痛癢癥狀消失或明顯減輕，證明其“清火解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、消腫止痛”的功效。

本研究采用兔耳增生性瘢痕的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)觀察云南琵琶甲制劑對(duì)兔耳增生性瘢痕的作用，觀察其對(duì)瘢痕組織形態(tài)學(xué)的影響。我們參照文獻(xiàn)[12-13]制作了兔耳增生性瘢痕模型，結(jié)果顯示大體形態(tài)學(xué)變化、組織學(xué)變化以及成纖維細(xì)胞密度與瘢痕增生指數(shù)變化符合文獻(xiàn)報(bào)道，表明動(dòng)物模型復(fù)制成功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明云南琵琶甲制劑對(duì)兔耳瘢痕組織增生有明顯的抑制作用，表現(xiàn)為與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組真皮層厚度、瘢痕增生指數(shù)較小，成纖維細(xì)胞數(shù)目明顯減少，膠原纖維致密下降，排列較規(guī)則，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1表達(dá)明顯減少。云南琵琶甲制劑防治瘢痕具有安全、有效、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，將有廣闊的前景，其具體有效成分及作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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[收稿日期]2014-07-25 [修回日期]2014-08-31

編輯/何志斌