李學(xué)龍 楊鎮(zhèn) 王娜 龔娜 馬曉穎 楊濤

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心，遼寧沈陽 110161）お

摘要

［目的］優(yōu)化北高叢藍(lán)莓內(nèi)生真菌的液體發(fā)酵條件。［方法］以一株分離自北高叢藍(lán)莓的內(nèi)生真菌菌絲提取物為研究對(duì)象，對(duì)液體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。選擇一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)基：玉米粉90 g/L，豆粕5 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 0.6 g/L，維生素B1 10 ﹎g/L，以菌絲體得率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量，以確定最適培養(yǎng)條件。［結(jié)果］在培養(yǎng)溫度25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，pH值7.0，接種量5%時(shí)，菌絲體生長量達(dá)到最大。［結(jié)論］初步得到該菌的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定依據(jù)。

關(guān)鍵詞 發(fā)酵；內(nèi)生真菌；培養(yǎng)條件；動(dòng)力學(xué)分析

中圖分類號(hào) SB188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2014）19-06157-02

お

The Growth Kinetics Analysis and Fermentation Conditions Optimization of a Strain of North High Plexus Endophytic Fungus from Blueberry

LI Xue瞝ong, YANG Tao et al

(Microbial Engineering Center, Liaoning Academy of Agricultural Sciences, Shenyang, Liaoning 110161)

Abstract ［Objective］ To optimize the liquid fermentation conditions of a strain of north high plexus endophytic fungus from blueberry. ［Method］ A medium suitable for industrial production was selected: corn flour 90 g/L, soybean meal 5 g/L, KH2PO4 1 g/L, MgSO4 0.6 ゞ/L, vitamin B1 10 mg/L. With mycelium yield as index, the culture medium temperature, pH, shaking speed, inoculum was investigated through orthogonal test in order to determine the optimum culture conditions. ［Result］ The results showed that the cultivation temperature 25 ℃, shaking speed 160 r/min, pH 7.0, inoculum 5%, mycelium growth reaches the maximum. ［Conclusion］ The microbial growth kinetics parameters were obtained, which will provide a basis for industrial production.

Key wordsFermentation; Endophytic fungi; Culture conditions; Dynamic analysis

お

基金項(xiàng)目 遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.201102100）。

作者簡介

李學(xué)龍（1984-），男，黑龍江牡丹江人，助理研究員，碩士，從事植物內(nèi)生菌發(fā)酵工藝研究。*通訊作者，研究員，博士，從事農(nóng)業(yè)微生物資源研究。

收稿日期 20140528

植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生促進(jìn)植物生長物質(zhì)，如植物生長素、赤霉素、細(xì)胞激動(dòng)素等，能直接促進(jìn)植物生長。從蘭科藥用植物中分離的5種內(nèi)生真菌能產(chǎn)生赤霉素、吲哚乙酸、脫落酸、玉米素、玉米核苷等植物激素，對(duì)蘭花的生長發(fā)育有較好的促進(jìn)作用［1-2］。研究表明，內(nèi)生菌可通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)傳導(dǎo)作用對(duì)植物體施加影響［3］。植物內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、質(zhì)量易于控制等優(yōu)勢，有利于規(guī)?；a(chǎn)［4-6］。目前對(duì)北高叢藍(lán)莓內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物研究較少，筆者選擇一種適合工業(yè)發(fā)酵的培養(yǎng)基，并通過液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化及生長動(dòng)力學(xué)分析，以期為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1

供試菌株。由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心實(shí)驗(yàn)室從北高叢藍(lán)莓根內(nèi)分離，編號(hào)為LM003。

1.1.2

主要儀器。pH電極和溶氧電極，均購自梅特勒-托利多儀器有限公司；發(fā)酵罐，購自上海保興生物設(shè)備工程有限公司；搖床，購自哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；培養(yǎng)箱，購自施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司。

1.1.3

主要試劑。所用試劑均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1

培養(yǎng)基的制備。①斜面及平板培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 ml，121 ℃滅菌25 min。②種子培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，麥芽粉5 g，維生素B1 0.5 mg，蒸餾水1 000 ml，121 ℃滅菌25 min。③發(fā)酵培養(yǎng)基。玉米粉90 g，豆粕5 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4 0.6 g，維生素B1 10 mg，蒸餾水1 000 ml，121 ℃滅菌25 min。

1.2.2

菌種活化。將編號(hào)LM003的菌種從試管斜面上接到平板培養(yǎng)基上，恒溫25 ℃培養(yǎng)7 d。

1.2.3

一級(jí)種子培養(yǎng)。將活化好的真菌用打孔器瓊脂挖塊接種于裝有200 ml種子培養(yǎng)基的三角瓶，于25 ℃，160 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)3 d作為種子。

1.2.4

液體發(fā)酵有關(guān)參數(shù)的考察。通過4因素3水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表1）考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量等條件對(duì)菌絲體生長的影響，篩選最佳發(fā)酵條件。

お

表1 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

水平 A溫度∥℃ B pH C轉(zhuǎn)速∥r/min D接種量∥%

1 20 6 120 5

2 25 7 140 10

3 30 8 160 15

1.2.5

液體深層發(fā)酵的生長動(dòng)力學(xué)考察。將確定的發(fā)酵培養(yǎng)基裝于10 L發(fā)酵罐中，裝量為6 L，121 ℃滅菌20 min，冷卻后接種一級(jí)種子，接種量為5%，溫度25 ℃，初始pH 7.0，攪拌轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)7 d，每天取樣。將收獲的發(fā)酵液過濾，菌絲體用蒸餾水洗滌，80 ℃烘干3 h后測干重，發(fā)酵液直接用于pH和殘?zhí)堑臏y定，制得生長代謝曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 一級(jí)種子液培養(yǎng)情況

搖床培養(yǎng)前2 d，接入的菌絲塊呈球狀不斷增大，發(fā)酵液較澄清，第3~5天出現(xiàn)大量微小菌絲球，并不斷增長，發(fā)酵液較粘稠，培養(yǎng)至第5天接入搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)參數(shù)的考察。

2.2 液體培養(yǎng)有關(guān)參數(shù)的確定

液體培養(yǎng)中，培養(yǎng)基初始體積的不同，對(duì)菌絲體干濕重之比影響較大，因此實(shí)驗(yàn)中采用菌絲體干重來衡量菌絲體生長情況，以g/L記。以下試驗(yàn)以液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

由表2可知，對(duì)菌絲體生長的影響因素由大到小的順序是培養(yǎng)基pH值＞培養(yǎng)溫度＞搖床轉(zhuǎn)速＞接種量。菌體最適培養(yǎng)條件為A2B2C3D1該培養(yǎng)條件下，菌絲體干重為20.5 ゞ/L。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析可知，pH值對(duì)液體菌種的培養(yǎng)有顯著影響（玃<0.05）。pH值除了對(duì)菌體本身的影響外，還影響培養(yǎng)基中的有機(jī)化合物的離子化和營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度，從而影響菌體對(duì)基質(zhì)的利用速度。

表2 液體培養(yǎng)條件的正交設(shè)計(jì)結(jié)果

因素 A B C D 菌絲體干重∥g/L

1 1 1 1 1 17.3

2 1 2 2 2 18.0

3 1 3 3 3 12.5

4 2 1 2 3 19.7

5 2 2 3 1 20.5

6 2 3 1 2 13.2

7 3 1 3 2 19.5

8 3 2 1 3 19.1

9 3 3 2 1 11.0

玐1 15.93 18.83 16.53 16.27

X2 17.80 19.20 16.23 16.90

X3 16.53 12.23 17.50 17.10

R 1.87 6.97 1.27 0.83

2.3 生長動(dòng)力學(xué)考察結(jié)果

2.3.1

生長量變化曲線。 圖1表明，菌絲體在0~1 d生長緩慢，為生長適應(yīng)期，第2天起可見絮狀菌絲逐漸增多。在第2~3天為對(duì)數(shù)生長期，菌絲體急劇增加，菌絲相互纏繞形成菌絲球。第4~5天為穩(wěn)定生長期，體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物積累較多，第6~7天菌絲體生物量減少，發(fā)酵液變粘稠，開始自溶。因此確定菌絲體較適合的收獲時(shí)間為第4~5天。

圖1菌絲體液體深層培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌絲生長量的影響

2.3.2

糖代謝曲線。圖2表明，菌絲體的生長過程在第1~3天對(duì)糖的利用比較迅速，最初糖濃度為19.0 g/L，培養(yǎng)7 d時(shí)剩余的還原糖濃度為9.7 g/L，生長過程中平均消耗速率為1.3 g/L·d，在對(duì)數(shù)生長期內(nèi)還原糖吸收利用較快，濃度從17.1 g/L降到12.4 g/L，均消耗速率為2.35 g/L·d，第4~6天對(duì)糖的利用趨于緩慢。糖代謝曲線的趨勢與菌絲體生長量的變化的趨勢基本相符。

圖2糖代謝曲線

2.3.3

pH值變化曲線。圖3表明，菌絲體的液體培養(yǎng)過程中，pH值在7.0~5.15范圍內(nèi)波動(dòng)，基本保持穩(wěn)定。培養(yǎng)的第2~3天pH下降較快，第4~7天變化較小，第7天pH小幅上升，可能與菌絲體自溶有關(guān)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)發(fā)酵液pH值為5.19。

圖3pH值變化曲線

2.3.4

溶氧DO變化曲線。圖4表明，在菌體的生長過程中，溶氧值在21%~100%范圍內(nèi)波動(dòng)。菌體發(fā)酵0~1 d的溶氧變化較小，經(jīng)過24 h后，溶氧開始明顯下降，菌體代謝旺盛，表現(xiàn)為對(duì)數(shù)生長階段。發(fā)酵至4~6 d時(shí)，溶氧下降緩慢，菌體進(jìn)入平衡生長期。發(fā)酵至6~7 d時(shí)發(fā)酵液溶氧值基本無變化，菌體生長基本保持停止?fàn)顟B(tài)，發(fā)酵結(jié)束。

圖4 溶氧值變化曲線

3 結(jié)論與討論

液體深層培養(yǎng)條件不僅影響菌絲體的生長速度和形態(tài)，而且對(duì)代謝產(chǎn)物的生成及后續(xù)提取也有很大影響，所以選擇合適的培養(yǎng)條件對(duì)獲得大量菌絲體和代謝產(chǎn)物具有重要

意義［7］。正交試驗(yàn)表明，菌絲體最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度

25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，接種量5%，培養(yǎng)基pH 7.0,該培養(yǎng)條件下，菌絲體干重為20.5 g/L。該培養(yǎng)基價(jià)格低廉，來源廣泛，適合工業(yè)化生產(chǎn)使用。

生長動(dòng)力學(xué)分析顯示，菌絲體的生長基本呈“S”型曲線，第4~5天為穩(wěn)定生長期，菌體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物積累較多，是收獲菌體的最佳時(shí)間。大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的過程，發(fā)酵的逐級(jí)放大階段不是培養(yǎng)體積的簡單放大，需要調(diào)節(jié)溫度、pH、溶解氧、細(xì)胞生長及產(chǎn)物形成等發(fā)酵參數(shù)，以提高發(fā)酵效率。因此要進(jìn)一步研究上述發(fā)酵參數(shù)的變化情況，為大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

［1］ ADHIKARI T B，JOSPH C M.Evaluation of bacteria isolated from rice for plant growth promotion and biological control of seeding disease of rice［J］.Can J Microbiol,2001,47:916-924.

［2］ 李玉珍.植物激素的研究進(jìn)展［J］.河南科技學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,35（4）:50-53.

［3］ 余朝閣,李天來，杜妍妍，等.植物誘導(dǎo)抗病原性及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［J］.北方園藝,2007(7):73-76.

［4］ 汪宇,于榮敏，佟志清，等.蛹蟲草液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化及生長動(dòng)力學(xué)考察［J］.中國野生植物資源,2003（8）:5-6.

［5］ 李亞東，郝瑞，陳偉，等.越桔對(duì)長白山區(qū)酸性土壤的適應(yīng)性［J］.園藝學(xué)報(bào)，1994，21(2):129-133.

［6］ 弓明欽，陳應(yīng)龍，仲崇祿.菌根研究及應(yīng)用［M］.北京:中國林業(yè)出版社，1997：51-60.

［7］ 司美茹，薛泉宏，來航線.放線菌分離培養(yǎng)基篩選及雜菌抑制方法研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2004，31(2):61-65.