孫林　耿其芳

摘要

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)。深入了解珍稀瀕危植物遺傳多樣性水平及其影響因素，對其保護(hù)及可持續(xù)利用具有十分重要的意義。近年來，隨著標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，珍稀瀕危植物遺傳多樣性研究的發(fā)展得到極大的推進(jìn)。概述了研究珍稀瀕危植物的常用標(biāo)記方法，包含形態(tài)標(biāo)記、染色體標(biāo)記、生化標(biāo)記及DNA分子標(biāo)記。同時(shí)，歸納了影響珍稀瀕危植物遺傳多樣性的影響因素。

關(guān)鍵詞 珍稀瀕危植物；遺傳多樣性；標(biāo)記；影響因素

中圖分類號 S184 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03793-06

Abstract Since genetic diversity is the foundation of biological diversity， an indepth understanding of the genetic diversity of rare and endangered plants and their influencing factors is of great significance to carry out the protection and sustainable utilization. In recent years， with the rapid development of marker technology， researches about the genetic diversity of rare and endangered plants have been greatly promoted. This paper provided an overview of methods of markers commonly used， including morphological marker， chromosomal marker， biochemical marker and DNA molecular marker. In addition， it summarized the impact of factors influencing the genetic diversity of rare and endangered plants.

Key words Rare and endangered plants； Genetic diversity； Markers； Influencing factors

生物多樣性是近年來生物學(xué)、生態(tài)學(xué)研究的重要課題之一。對于生物多樣性，普遍接受的是美國國會技術(shù)評價(jià)辦公室（1987）的定義，即生命有機(jī)體及其賴以生存的生態(tài)綜合體的多樣性和變異性。一般來說，生物多樣性可以分解為3個(gè)層次的多樣性，即遺傳多樣性、物種多樣性及生態(tài)系統(tǒng)多樣性。其中，遺傳多樣性即是生物多樣性的基礎(chǔ)，也是其最重要的組成部分。遺傳多樣性對物種水平的多樣性具有決定性的作用。這是因?yàn)檫z傳多樣性是物種穩(wěn)定性、進(jìn)化潛力的來源。物種的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值也得益于其特有的基因組成。因而，保護(hù)生物多樣性最終是要保護(hù)遺傳多樣性[1]。

遺傳多樣性是生物的一種自然屬性。它形成于自然界中生物的長期進(jìn)化、發(fā)展過程，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，不僅存在于不同物種之間、同一物種的不同種群之間，而且存在于同一種群的不同個(gè)體之間。此外，遺傳多樣性還具有特異性，即任何物種都具有特有的基因序列和遺傳結(jié)構(gòu)，也就是說生物世界中存在著極為豐富的遺傳突變。種內(nèi)遺傳多樣性的豐富度對物種的生存至關(guān)重要。一個(gè)居群（或物種）遺傳多樣性越高即遺傳變異越豐富，對外界環(huán)境變化的潛在適應(yīng)性就越強(qiáng)，越易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新的環(huán)境。

物種等位基因數(shù)目或頻率的變化是遺傳多樣性變化的本質(zhì)原因。這種變化會受到很多因素的影響，包括物種的生殖方式、遺傳漂變、基因流、自然選擇和基因突變等，也包括由人為干擾或環(huán)境變化等因素導(dǎo)致的生境破碎化、種群隔離及物種滅絕。對珍稀瀕危植物遺傳多樣性的研究可以揭示物種或居群的進(jìn)化歷史（起源時(shí)間、方式等），探討物種稀有或?yàn)l危原因和過程，并且進(jìn)一步分析其進(jìn)化潛力。分子水平的遺傳多樣性研究，一方面能夠?yàn)橛H本選配、后代遺傳變異程度和雜種優(yōu)勢的預(yù)測提供重要參考，另一方面可以研究品種間的系譜關(guān)系，從而進(jìn)行品種鑒定、分類以及分析物種的起源與進(jìn)化。

1 遺傳多樣性的分析方法

多樣性存在于生物界的各個(gè)層級，對應(yīng)于此，遺傳多樣性的分析手段也是針對于不同層級進(jìn)行的。隨著生物學(xué)研究層級的提高及生物學(xué)尤其是遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，檢測遺傳多樣性的方法不斷地得到提高與完善。分析方法已從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)層次、細(xì)胞（染色體）層次和生理生化層次發(fā)展到分子標(biāo)記層次。盡管遺傳多樣性的分析方法發(fā)展迅速，但仍未找到一種可以完全取代其他方法的技術(shù)[2]。

1.1 形態(tài)標(biāo)記（Morphological marker）

形態(tài)標(biāo)記是利用植物外部形態(tài)特征的差異來區(qū)分個(gè)體的方式。株高、粒色、種子干重、葉片大小等易于觀測的特征都可以用來運(yùn)用形態(tài)標(biāo)記的方法。由于形態(tài)表現(xiàn)型和基因型間存在著基因表達(dá)、調(diào)控、個(gè)體發(fā)育等復(fù)雜環(huán)節(jié)，所選標(biāo)記特征上的差異能否反映基因型水平上的差異自然成為該種標(biāo)記方法成功與否的關(guān)鍵。

運(yùn)用形態(tài)標(biāo)記方法研究植物遺傳多樣性的經(jīng)典試驗(yàn)就是孟德爾的豌豆試驗(yàn)。通過對豌豆形態(tài)表型特征的觀察與統(tǒng)計(jì)，孟德爾發(fā)現(xiàn)遺傳因子的分離和自由組合定律。表型標(biāo)記方法具有直接性與簡便性[3-4]。利用該方法，可以在短時(shí)間內(nèi)對研究對象的遺傳多樣性水平有一個(gè)粗略的了解。其缺點(diǎn)是數(shù)量少。通過該方法所能準(zhǔn)確分析的基因位點(diǎn)很少，所以不足以客觀地評估所研究物種的多態(tài)性。況且植物的表型在遺傳表達(dá)的過程中易受外部環(huán)境的影響，所以未必所有的表型差異都能夠反映基因?qū)用嫔系亩鄳B(tài)性。Travis等[5]為了研究雜交在亞利桑那巖崖玫瑰（Purshia subintegra Rosaceae）這一珍稀灌木中的作用，對美國亞利桑那州中部的4個(gè)種群進(jìn)行表型標(biāo)記和分子標(biāo)記（AFLP）的分析，發(fā)現(xiàn)基于表型和基于基因標(biāo)記的群體間遺傳距離之間的相關(guān)性很低，意味著表型標(biāo)記并非總是能夠準(zhǔn)確地表征基因雜合程度。不過，表型標(biāo)記直接與簡便的特點(diǎn)仍是其他標(biāo)記方法所不具備的，因此即使當(dāng)前的標(biāo)記技術(shù)已十分發(fā)達(dá)，表型標(biāo)記的應(yīng)用仍較廣泛。通過與其他標(biāo)記手段相結(jié)合，能夠更客觀地反映植物的遺傳多樣性水平。Borba等[6]通過表型、群落統(tǒng)計(jì)學(xué)及基因分子標(biāo)記方法對巴西瀕危蘭科植物Sophronitis sincorana進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)表型多樣性與基因多樣性之間缺乏關(guān)聯(lián)性，表明物種的保護(hù)不能僅應(yīng)用某一種標(biāo)記。金則新等[7]比較了瀕危植物夏蠟梅（Sinocalycanthus chinensis）大明山、大雷山與龍須山3個(gè)居群的果實(shí)與種子的形態(tài)變異。研究表明，果實(shí)的各項(xiàng)指標(biāo)例如果柄長、果實(shí)重等都是大明山居群最大，龍須山居群最小，大雷山居群居中，且它們之間差異顯著（P<0.05）；而種子的各項(xiàng)指標(biāo)均是大雷山居群最大，與大明山居群和龍須山居群差異顯著（P<0.05）。黃焱[8]通過研究發(fā)現(xiàn)中國特有的珍稀瀕危植物珍珠黃楊種內(nèi)存在豐富的群體間、群體內(nèi)表型變異，其8個(gè)群體的枝葉等17個(gè)表型性狀差異顯著（P<0.05），變異系數(shù)較大。

值得注意的是，在其他標(biāo)記方法研究因?yàn)槟承┰蛏胁荒苌钊霊?yīng)用的情況下，表型標(biāo)記往往能夠更直觀地體現(xiàn)種間或種內(nèi)群體間的遺傳分化。李雪萍等[9]結(jié)合形態(tài)標(biāo)記及ISSR、AFLP 2種分子標(biāo)記技術(shù)，綜合分析珙桐和光葉珙桐的差別，發(fā)現(xiàn)珙桐與光葉珙桐的差別僅在其葉片的形態(tài)特征方面，分子層面是否存在差異還有待于進(jìn)一步研究。

1.2 染色體標(biāo)記（Chromosomal marker）

染色體是遺傳物質(zhì)的載體，是基因的攜帶者。染色體的變異主要包括染色體數(shù)目的變異和結(jié)構(gòu)的變異2個(gè)方面。

染色體數(shù)目的變異包含整倍的和非整倍的變化2種情況。整倍體和非整倍體（如缺體、單體、三體等）都有其特定的細(xì)胞學(xué)特征，都可以作為一種染色體標(biāo)記。Sanchez等[10]對發(fā)現(xiàn)于墨西哥的3個(gè)珍稀瀕危的類蜀黍種群進(jìn)行研究，通過對其染色體倍型的區(qū)分，結(jié)合表型、生態(tài)及分子標(biāo)記等方面的特征，最終將其確定為玉蜀黍?qū)俜泵衩讈唽俚?個(gè)分化顯著的種群。通過細(xì)胞學(xué)標(biāo)記分析，Linda等[11]發(fā)現(xiàn)，對于僅存在于Colorado Front Range地區(qū)的珍稀植物Physaria bellii的保護(hù)，相較于種間雜交，棲息地不斷減少的威脅更大。對愛達(dá)荷州一種當(dāng)?shù)靥赜姓湎≈参顲astilleja christii及另外2個(gè)同屬物種Castilleja minitata、Castilleja linariifolia的染色體組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)物種的倍型都是雙倍體，試驗(yàn)分析的所有Castilleja christii植株個(gè)體均同時(shí)包含Castilleja minitata與Castilleja linariifolia的基因組。結(jié)合顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅱ序列與26個(gè)表型特征，Danielle等[12]發(fā)現(xiàn)，Castilleja christii是Castilleja minitata與Castilleja linariifolia 2個(gè)同倍體物種雜交得到的新物種。

另外，染色體結(jié)構(gòu)的變異在植物中更為普遍。約500個(gè)個(gè)體中就會存在1個(gè)染色體結(jié)構(gòu)變異[13]。缺失、重復(fù)、倒位和易位是染色體結(jié)構(gòu)變異的4種類型。此外，還可以利用染色體的形態(tài)、縊痕和隨體等核型特征上的變異標(biāo)記染色體水平上的多樣性。

1.3 生化標(biāo)記（Biochemical marker）

植物組織的蛋白粗提物中含有許多不同的貯藏蛋白和同工酶等生化物質(zhì)。生化標(biāo)記即以此為標(biāo)記。通過電泳和染色法，將蛋白質(zhì)的多種形式轉(zhuǎn)化為酶譜帶型。據(jù)此，可以進(jìn)行物種間親緣關(guān)系的分析及純度鑒定。

不同于形態(tài)標(biāo)記和染色體標(biāo)記，生化標(biāo)記只需對采自植物的少量樣品進(jìn)行分析。此外，生化標(biāo)記方法受環(huán)境的影響較小，可以直接反映基因產(chǎn)物的差異。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，1970～2001年間國外有關(guān)云杉屬植物遺傳多樣性論文中，同工酶研究占50%以上[14]。趙永亮等[15]采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳技術(shù)，利用過氧化物（POD）同工酶和淀粉酶（AS）同工酶對11個(gè)金銀花樣品的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)金銀花的親緣關(guān)系與其遺傳本質(zhì)、地理位置有關(guān)。孫彩云等[16]利用5種酶系統(tǒng)能夠成功地將供試品種和變種區(qū)分開，并劃分為墨蘭和春蘭。不過，生化標(biāo)記并非對所有編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行分析，而是只可以分析編碼可溶性酶的基因，且只能在產(chǎn)物易于提取和能在凝膠上電泳檢測的基礎(chǔ)上。所以，這種標(biāo)記方法可分析的位點(diǎn)是有限的[17]。

1.4 DNA分子標(biāo)記（DNA molecular marker）

前面3種標(biāo)記方法都是對基因的間接反映，而DNA分子標(biāo)記則是以DNA分子堿基序列的變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記方法，更能直接地揭示植物基因組DNA水平上的多態(tài)性。理論上，對任何DNA分子片段都能進(jìn)行分析，所以DNA分子的遺傳標(biāo)記幾乎是無窮的。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)同樣是隨著生物學(xué)的發(fā)展而產(chǎn)生的，特別是分子生物學(xué)技術(shù)的深入發(fā)展，使得分子標(biāo)記技術(shù)逐漸形成更理想的標(biāo)記方法。

1.4.1

RFLP。RFLP是DNA限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism）的簡稱。RFLP是最早的分子標(biāo)記技術(shù)，由美國人Botstein在1980年提出。該方法是利用已知的限制性內(nèi)切酶酶切個(gè)體基因組DNA，然后用已標(biāo)記的探針與之雜交。由于各種限制性內(nèi)切酶能夠識別專一的堿基序列，DNA序列的變化會增減酶切位點(diǎn)的數(shù)目，因此在不同個(gè)體中與同一探針雜交的DNA片段會存在長度上的差異，即顯示出多樣性。

研究表明，運(yùn)用RFLP技術(shù)，能夠確定2種瀕危馬櫻丹屬植物，Lantana depressa var.depressa和Lantana depressa var.floridana與外來種Lantana strigocamara之間發(fā)生雜交現(xiàn)象[18]。Elansary等[19]還將RFLP技術(shù)應(yīng)用于瀕危水生肉食性植物 Aldrovanda vesiculosa的研究。Holderegger等[20]應(yīng)用RFLP技術(shù)鑒別區(qū)分珍稀瀕危植物European Black Poplar（Populus nigra）與親緣外來種American Black Poplar（Populus deltoides）、雜交種Black Poplar（Populusx canadensis），并且該類分子標(biāo)記的應(yīng)用是保護(hù)這種珍稀瀕危植物的前提。利用同工酶電泳及葉綠體PCRRFLP相結(jié)合的方法，Machon等[21]對巴黎地區(qū)的瀕危植物 Equisetum variegatum Schleicher進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)對無性生殖的過多依賴是該物種遺傳多樣性過低的原因。

1.4.2

RAPD。RAPD是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphism，DNA）的簡稱。RAPD技術(shù)的出現(xiàn)得益于1985年美國Getus公司的Mullis 等發(fā)明的一種特異性DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）[22]。RAPD是利用隨機(jī)引物（通常為10個(gè)核苷酸）對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生多態(tài)性的DNA片段[23]，而后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)EB染色或放射自顯影來檢測DNA序列的多態(tài)性。

黃紹輝等[24]通過RAPD技術(shù)對我國特有瀕危植物連香樹（Cercidiphyllum japonicum）進(jìn)行研究。20個(gè)引物共計(jì)擴(kuò)增出691條DNA片段，其中多態(tài)性條帶328條，占總條帶的47.5%。分析表明，連香樹基因分化系數(shù)是0.479 7，居群內(nèi)變異占變異總量的52.03%，基因流僅為0.542 4。并且，推測遺傳漂變可能是連香樹當(dāng)前遺傳結(jié)構(gòu)的主要成因。對僅分布于夏威夷地區(qū)的瀕危植物Euphorbia kuwaleana進(jìn)行RAPD分析，Morden等[25]發(fā)現(xiàn)盡管該物種的分布僅局限于3個(gè)小居群，但它的遺傳多樣性竟與近緣非瀕危物種持平，甚至更高。高燕會等[26]采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分析浙江省內(nèi)金錢松（Pseudolarix amabilis）的遺傳多樣性。18條引物在62個(gè)樣品中可檢測到172個(gè)可重復(fù)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為170個(gè)，多態(tài)性比率為99.2%。這證明金錢松天然種群體存在較高的遺傳多樣性，并且建議對金錢松進(jìn)行就地保存和遷地保存。周則剛等[27]采用RAPD技術(shù)研究9個(gè)米心水青岡自然居群的遺傳關(guān)系和多樣性。20條隨機(jī)引物共擴(kuò)出260個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶有180條，多態(tài)位點(diǎn)比率為69.2%。研究表明，米心水青岡（Fagus engleriana Seem.）的遺傳多樣性水平處于中等，遺傳分化也處于中等水平。Hoyo等[28]對采用同工酶及RAPD技術(shù)研究僅分布于伊比利亞半島的Glandora oleifolia，證實(shí)其遺傳多樣性水平非常低，2個(gè)局域種群之間的遺傳分化水平也極低。

此外，近些年來，RAPD標(biāo)記技術(shù)還應(yīng)用于峨眉黃連（Coptis omeinesis （Chen） C.Y.Cheng）[29]、舟山新木姜子（Neolitsea sericea）[30]、小沙冬青（Ammopiptanthus nanus （M.Pop.） Chengf.）[31]、夏蠟梅（Calycanthus chinensis Cheng et S.Y.Chang）[32]、秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）[33]、苜蓿屬（Medicago Linn.）[34-36]、紅豆杉屬（Taxus Linn.）[37-40]、落葉木蓮（Manglietia deciduas）[41]、狹葉坡壘（Hopea chinensis）[42]等珍稀瀕危物種的研究。

1.4.3

AFLP。AFLP是擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism）的簡稱。AFLP是將RFLP技術(shù)與PCR技術(shù)結(jié)合，設(shè)計(jì)人工合成的限制性內(nèi)切酶通用接頭以及可以序列配對的專用引物，對不同材料DNA酶切片段存在的差異進(jìn)行選擇性擴(kuò)增[2]。在試驗(yàn)過程中，將雙鏈接頭連接到事先用限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生的DNA片段末端，然后以接頭序列和鄰近的限制性位點(diǎn)序列為引物結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，最后分離擴(kuò)增出的DNA片段進(jìn)行檢測[43]。

對山東省紫鍛（Tilia amurensis Ruprecht）進(jìn)行遺傳多樣性的AFLP分析，9對AFLP引物組合獲得1 370條有效條帶，充分證明AFLP標(biāo)記技術(shù)的可靠性、穩(wěn)定性與高效性[44]?；贏FLP技術(shù)分析捷克境內(nèi)極度瀕危種 Potamogeton praelongus，Kitner等[45]發(fā)現(xiàn)在僅存的一個(gè)自然種群中，Potamogeton praelongus的遺傳多樣性水平非常低。Eduardo等[46]通過對伊比利亞半島西北部特有瀕危植物Ranunculus cabrerensis 已知的4個(gè)居群進(jìn)行AFLP和ISSR分析，發(fā)現(xiàn)該物種無論在居群內(nèi)還是在居群間水平上都具有較高的遺傳多樣性，并且通過AMOVA分析確定主要的遺傳分化存在于居群內(nèi)部。Li等[47]對世上僅存的5株天目鐵木（Ostrya rehderiana）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這5株自然個(gè)體雖然多樣性位點(diǎn)很少，但是具有中等水平的雜合度。對150株人繁殖的個(gè)體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與5株自然個(gè)體相比，無論是雜合度還是多態(tài)性的位點(diǎn)都有很明顯的減少。錢鑫等[48]對扇脈杓蘭（Cypripedium japonicum）遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，扇脈杓蘭遺傳多樣性水平較低，與表型多樣性并不一致，其遺傳分化系數(shù)（Gst=0.517 8）大于蘭科植物。李曉楠等[49]建立并優(yōu)化了中國特有種華北落葉松的AFLP反應(yīng)體系。

1.4.4

SSR。SSR是簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeat）的簡稱，是基因組中簡單串聯(lián)重復(fù)序列因重復(fù)次數(shù)的不同而形成的多態(tài)性[50]?；蚪M中的重復(fù)序列按照重復(fù)單元的大小可分為衛(wèi)星序列（Satellite）、小衛(wèi)星序列（Microsatellite）和微衛(wèi)星序列（SSRs）。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)是DNA分子標(biāo)記技術(shù)中極具潛力的分子標(biāo)記，是目前最先進(jìn)的遺傳標(biāo)記技術(shù)之一[2]。

微衛(wèi)星的重復(fù)單元一般在2～5個(gè)核苷酸，串聯(lián)重復(fù)的長度可達(dá)幾十甚至幾百個(gè)核苷酸序列?？截悢?shù)目的不同造成微衛(wèi)星具有極為豐富的多態(tài)性。微衛(wèi)星兩端通常是保守序列，因此可以據(jù)該設(shè)計(jì)擴(kuò)增微衛(wèi)星的引物序列。直接對微衛(wèi)星進(jìn)行測序，然后根據(jù)兩端的核苷酸序列得到引物序列，無疑是最直接、最簡單的方法，但是鑒于工作量、經(jīng)濟(jì)等方面的考慮，通常不會選用這種方法。目前，依據(jù)相關(guān)原理而編寫出的引物設(shè)計(jì)軟件已經(jīng)被開發(fā)出來，在科研中也得到越來越廣泛的使用。同樣，因?yàn)槲⑿l(wèi)星兩端的引物通常是保守序列，微衛(wèi)星引物在同屬的親緣關(guān)系較近的物種之間具有一定的通用性，因此近緣物種篩選法也是獲取微衛(wèi)星引物的主要方法之一。該方法能夠大大節(jié)省投入在引物設(shè)計(jì)上的時(shí)間與成本等。張悅等[51]從馬尾松微衛(wèi)星引物中篩選出紅松ESTSSR標(biāo)記，并與現(xiàn)有的紅松基因組SSR標(biāo)記進(jìn)行對比分析。結(jié)果表明，2組引物都能準(zhǔn)確地反映紅松種群的遺傳多態(tài)性水平，新篩選的ESTSSRs可以用于紅松種群遺傳多樣性研究。

SSR標(biāo)記是一種共顯性的標(biāo)記，符合孟德爾式的分離和遺傳。此外，因數(shù)量豐富且均勻分布于整個(gè)基因組，所以SSR標(biāo)記能夠揭示較高水平的多態(tài)性。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、目標(biāo)基因的定位及指紋圖的繪制等研究中[2]。黃海燕等[52]通過試驗(yàn)建立起了適合杜仲的SSRPCR反應(yīng)體系，篩選出13對具有多態(tài)性的引物，為應(yīng)用SSR標(biāo)記方法研究杜仲的遺傳多樣性、親緣關(guān)系奠定基礎(chǔ)。覃瑞等[53]進(jìn)行了適用于野生軟棗獼猴桃遺傳多樣性分析的SSR引物篩選工作?；赟SR標(biāo)記的中國特有種迎春櫻自然居群遺傳多樣性分析表明，迎春櫻居群間的遺傳分化水平較高，基因交流受阻[54]。極度瀕危植物西疇含笑（Michelia coriacea）的SSR標(biāo)記、ISSR標(biāo)記研究表明，盡管生境片段化，在物種水平上，西疇含笑仍具有較高的遺傳多樣性，同時(shí)居群間的遺傳差異很低[55]。華仁杏（Armeniaca cathayana D.L.Fu et al.）是我國六大戰(zhàn)略性干果樹種之一，是近年發(fā)現(xiàn)的新種[56]。秦玥等[57]進(jìn)行了該物種SSR標(biāo)記的篩選與評價(jià)工作。白皮松（Pinus bungeana）是東亞唯一的三針?biāo)?，是我國特有種瀕危物種。周惠娟等[58]利用12對微衛(wèi)星引物對白皮松進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其群體遺傳多樣性中心在秦嶺南部與山西北部，遺傳變異主要源自群體內(nèi)部，自然居群呈現(xiàn)明顯的譜系地理格局。秦嶺地區(qū)國家三級保護(hù)野生瀕危物種華中五味子（Schisandra sphenanthera Rdhd.et Wils.）的SSR分析結(jié)果表明，該物種具有豐富的遺傳多樣性，其遺傳變異主要存在于居群內(nèi)部[59]。

1.4.5

SNP。SNP是單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）的簡稱，是指染色體基因組上由單堿基的變異（轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失）引起的DNA序列多樣性[60]。其中，單堿基的轉(zhuǎn)換與顛換最常見[61]。轉(zhuǎn)換是基因組某個(gè)位點(diǎn)上一種嘧啶/嘌呤置換另一種嘧啶/嘌呤，而顛換是嘌呤與嘧啶互換[62]。理論上，突變可以發(fā)生在任何一種堿基上，但實(shí)際上SNP較多發(fā)生在T和C之間[63]。在4種置換方式上，C→T（G→A）轉(zhuǎn)換最常見，約占2/3[64]。

早在1996年，Lander [65]便指出SNP標(biāo)記象征著新的分子標(biāo)記時(shí)代的開始?？v觀遺傳標(biāo)記發(fā)展的歷史，可以分為3代。第1、2代分別以Southern雜交技術(shù)和PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，而以SNP標(biāo)記為代表的第3代分子標(biāo)記則以基因序列為基礎(chǔ)。

由于基因組DNA中任意堿基均有發(fā)生變異的可能，SNP廣泛分布在整個(gè)基因組中。根據(jù)SNP所在位置的不同，可以分為cSNPs、iSNPs及pSNPs三類，分別位于基因編碼區(qū)、基因間和基因周邊[66]。根據(jù)是否對生物遺傳性狀產(chǎn)生影響，SNP又可以分為蛋白編碼SNP和非蛋白編碼SNP。其中，蛋白編碼SNP會編碼氨基酸序列。如果編碼的氨基酸序列沒有發(fā)生變化，即突變堿基與未突變堿基含義相同，那么該SNP是同義的；如果突變堿基與未突變堿基含義不同，所編碼的氨基酸序列發(fā)生改變，那么該SNP是非同義的。非同義蛋白編碼SNP往往會影響相應(yīng)蛋白質(zhì)的功能。

SNP標(biāo)記具有穩(wěn)定性高、代表性強(qiáng)、位點(diǎn)豐富、分布廣泛等特點(diǎn)，并且具有二等位性，易于實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化。隨著技術(shù)手段的不斷改進(jìn)，SNP標(biāo)記的檢測成本也將大大降低，因此SNP具有極高的理論與應(yīng)用價(jià)值。在眾多分子標(biāo)記中，SNP已成為研究最多、最具前景的標(biāo)記技術(shù)之一。王佳媛等[67]以采自四川麻咪澤和美姑大風(fēng)頂2個(gè)自然保護(hù)區(qū)的我國特有易危物種野生凹葉木蘭為材料，利用SNP分子標(biāo)記方法，發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)增出的4條510 bp的序列上，平均每73 bp左右的序列長度上就能夠檢測到一個(gè)SNP位點(diǎn)，說明2個(gè)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)不同居群的凹葉木蘭具有較高的遺傳多樣性。

2 影響因素

2.1 繁育系統(tǒng)（Reproduce system）

植物的繁育系統(tǒng)通常指對后代遺傳組成產(chǎn)生直接影響的所有有性特征。它主要包括花的綜合特征、花各性器官的壽命、花開放式樣、自交親和程度和交配系統(tǒng)，其中交配系統(tǒng)是核心[68]。由此可知，植物的繁育系統(tǒng)要比高等動(dòng)物復(fù)雜得多。它是決定植物群體遺傳結(jié)構(gòu)的最主要因素[1]。

一般而言，有性繁殖群體的遺傳多樣性比無性繁殖群體高。因?yàn)槠溥z傳信息分別來源于父本與母本個(gè)體，經(jīng)歷過基因重組，且利于基因突變。無性繁殖的群體遺傳多樣性通常較低。捷克境內(nèi)唯一的Potamogeton praelongus自然種群的遺傳多樣性偏低就是由占主導(dǎo)地位無性繁殖及人工培育的無性繁殖個(gè)體的栽種所導(dǎo)致的[45]。

植物的遺傳多樣性受交配方式的影響也較大。隨著自交（近交）率的提高，植物群體遺傳多樣性則越來越低。在自交、近交的物種中主要在種群間存在遺傳的多樣性，異交物種遺傳的多樣性則在群內(nèi)[69]。研究表明，普遍存在的自交現(xiàn)象是導(dǎo)致天目鐵木（Ostrya rehderiana）150株人工繁殖個(gè)體遺傳多樣性降低的原因之一[47]。

在近緣物種間，有可能通過雜交發(fā)生植物種間的基因漸滲。一方面，基因漸滲能產(chǎn)生新的組合基因型與生態(tài)型，擴(kuò)大種群遺傳的多樣性。另一方面，也存在物種合并的可能，特別是對于珍稀的瀕危植物，種間雜交很有可能使物種毀滅。此外，風(fēng)媒較蟲媒種子傳播的距離遠(yuǎn)，作為介導(dǎo)的基因流以及遺傳的多樣性相對較高，世代短的植物比世代長的植物遺傳的多樣性要豐富得多。

2.2 基因流（Gene flow）

基因流是群體間以及群體內(nèi)不同個(gè)體間基因信息的傳播和交流，通常通過花粉、種子以及克隆體的傳播實(shí)現(xiàn)?；蛄鞯某潭仁艿絺鞑シ绞?、傳播機(jī)制以及群體間地理距離的影響。長距離的基因流通常依靠種子的散布實(shí)現(xiàn)[70]。不過，距離越長，基因流的概率越低[71-72]。因此，居群間的地理距離越遠(yuǎn)，遺傳分化的程度也就越大。廣泛的基因流不但有益于維持群體內(nèi)部的基因遺傳多樣性在較高水平，而且會使不同群體之間逐漸均一化。Eduado等[46]研究表明，基因流的均一化作用防止了瀕危植物Ranunculus cabrerensis（Ranunculaceae）不同居群之間的差異性分化。

2.3 遺傳漂變（Genetic drift）

遺傳漂變是指在一個(gè)相對獨(dú)立的小種群中，子代個(gè)體的等位基因易受到少數(shù)親代個(gè)體沒有產(chǎn)生后代，或者個(gè)別等位基因沒有實(shí)現(xiàn)遺傳的影響，而與親代發(fā)生頻率上的隨機(jī)波動(dòng)。一般來說，頻率低的等位基因更易受到遺傳漂變作用的影響，在下一代中丟失的可能性也越高。

存在奠基者效應(yīng)（Founder effect）的群體中，同樣存在類似情況。所謂奠基者效應(yīng)是指由少數(shù)個(gè)體在遠(yuǎn)離原種群的一個(gè)新的棲息地建立新的群體，雖然個(gè)體的數(shù)量會逐漸增加，但是由于最初的少數(shù)個(gè)體只含有原種群的部分等位基因，又無法與其他種群存在基因的交流，新群體的遺傳多樣性會極其有限。

瓶頸效應(yīng)（Bottleneck effect）是遺傳漂變的一種特殊情況。如果一個(gè)群體中的個(gè)體由于火災(zāi)、病蟲害、氣候劇變等原因，個(gè)體數(shù)量突然大量減少，由幸存的少數(shù)個(gè)體再次擴(kuò)展形成新的群體，由于僅保留原種群的少數(shù)基因型，新種群的遺傳多樣性也會顯著降低，便會產(chǎn)生瓶頸效應(yīng)。Hoyo等[28]推斷 Glandora oleifolia（Boraginaceae）在第四紀(jì)冰川運(yùn)動(dòng)時(shí)代經(jīng)歷了數(shù)次瓶頸效應(yīng)或局部種群的滅絕。利用BOTTLENECK軟件瓶頸效應(yīng)檢測結(jié)果表明，白皮松群體很有可能經(jīng)歷了近期的瓶頸效應(yīng)，同時(shí)個(gè)別群體具有歷史擴(kuò)張事件[58]。與基因流的作用恰好相反，遺傳漂變會使得群體內(nèi)部的遺傳多樣性程度大大降低，不同的群落也會發(fā)生較快速的分化。

2.4 自然選擇（Natural selection）

自然選擇是進(jìn)化生物學(xué)理論中最核心的概念，是進(jìn)化過程的主要機(jī)制。自然選擇學(xué)說強(qiáng)調(diào)物種內(nèi)部存在可遺傳的變異。在長期進(jìn)化過程中，那些有利于物種更好適應(yīng)生存環(huán)境的基因型將得到保留，而那些不利的基因型則被淘汰。

自然選擇對植物表型性狀的影響十分明顯。一般認(rèn)為，生物多樣性與環(huán)境差異密切相關(guān)，自然選擇作用越強(qiáng)，生物多樣性就越豐富[73]。經(jīng)過自然選擇，植物種群內(nèi)部一些有利的變異得到積累，從而有可能產(chǎn)生適應(yīng)特定生境的新的生態(tài)型甚至是新物種[74]。不同的選擇方式對植物群體的遺傳多樣性會產(chǎn)生不同的影響。一般說來，定向性選擇和穩(wěn)定性選擇會淘汰較多的基因型，導(dǎo)致植物群體遺傳多樣性降低，而分裂性選擇則會保留具有不同表型性狀的基因型，使得植物群體遺傳多樣性增加。

2.5 人為干擾（Human disturbance）

隨著人類活動(dòng)的增加，人為干擾對瀕危植物遺傳多樣性產(chǎn)生了深刻的影響。各種人類用地（農(nóng)牧、城鎮(zhèn)住房、修建工廠、道路橋梁等工程）的擴(kuò)張、旅游業(yè)的發(fā)展以及人為因素導(dǎo)致的外來物種的入侵等都會造成珍稀瀕危植物生境的喪失與破壞，加之對珍稀瀕危植物本身的過度利用，已對物種的生存產(chǎn)生極為嚴(yán)重的威脅，并且使得人類活動(dòng)已成為造成現(xiàn)代物種滅絕的首要原因[75]。研究表明，夏威夷特有瀕危物種Euphorbia kuwaleana（Euphorbiaceae）植株個(gè)體過低（不足1 000株）主要源于外來物種的入侵、周期性的火災(zāi)[25]。Qian等[76]對中國特有珍稀蘭花品種無距蝦脊蘭（Calanthe tsoongiana）進(jìn)行遺傳多樣性及居群分化的分析，發(fā)現(xiàn)在物種水平上，該物種具有較大的遺傳多樣性，而居群水平很低，且6個(gè)居群間只有有限的基因流。結(jié)合實(shí)際生境推斷，這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是人類活動(dòng)造成的生境喪失及破碎。

此外，全球變暖、江河污染、酸雨頻發(fā)等不分國界、不限地域的全球性變化也在對整個(gè)生物圈產(chǎn)生越來越大的影響。

3 結(jié)語

珍稀瀕危植物的遺傳多樣性會同時(shí)受到多種因素的影響和制約。直接作用于植物基因組，引起等位基因數(shù)目、頻率發(fā)生變化的因素如植物繁育系統(tǒng)、遺傳漂變、基因流等為內(nèi)部因素，通過其他間接方式影響植物遺傳多樣性的因素則為外部因素。誠然，由于人類活動(dòng)的日益頻繁，人為造成的植物資源的過度利用及生境的破碎、喪失已經(jīng)成為威脅珍稀瀕危植物生存的最主要因素，但是不容忽視的是，繁育系統(tǒng)、基因流、自然選擇等也會嚴(yán)重制約物種的生存。因此，只有綜合各因素的影響作用，才能制定出科學(xué)的保護(hù)措施。

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