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RP—HPLC法同時測定藏藥手掌參中3種抗AD活性成分的含量

2014-04-29 15:05:27姚晶林鵬程
安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年13期
關(guān)鍵詞:藏藥手掌天麻

姚晶 林鵬程

摘要 [目的]建立同時測定藏藥手掌參中天麻素、dactylorhin A和militarine的含量測定方法。[方法]采用反相高效液相色譜法(RPHPLC),以ZORBAX SBC18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;進(jìn)樣10 μl;乙腈-濃度0.5%的磷酸水梯度洗脫(0 min,7%;10 min,15%;20 min,20%;25 min,23%;30 min,40%;35 min,40%);流速為0.7~1.0 ml/min;柱溫30 ℃;檢測波長222 nm。[結(jié)果]在35 min內(nèi)完成對3種抗AD活性成分的分析,各成分之間均達(dá)到基線分離。天麻素、dactylorhin A和militarine的線性范圍分別為:0.031 34~1.003 00 mg/ml(R=0.999 8)、0.038 06~1.218 00 mg/ml(R=0.999 6)、0.039 28~1.257 00 mg/ml(R=0.999 6);平均加樣回收率(n=6)分別為98.88%、99.91%和100.48%。測定得青藏高原15個不同地區(qū)不同種屬的手參中3種抗AD活性成分的含量,以互助變異手參的含量最高。[結(jié)論]該方法建立的HPLC分析方法簡單準(zhǔn)確,能快速測定手參中有效成分的含量,青藏高原不同地區(qū)不同種屬手參中3種抗AD活性成分含量差異較大。

關(guān)鍵詞 RPHPLC;手掌參(Gymnadenia conopsea R.Br.);天麻素;dactylorhin A;militarine;含量測定

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611(2014)13-03865-03

Abstract [Objective] To determine the content of gastrodin, dactylorhin A and militarine in Tibetan herb Gymnadenia conopsea. [Method] The sample were separated on the column of ZORBAX SBC18 (4.6 mm×250 mm,5 μm) which eluted with Acetonitrile(A) and water(B, 0.5% phosphoric acid). The sample size was 10 μl. The initial condition was 7%A, chsnhrf to 15%A in 10 min, to 20%A in 10 min, to 23% in 5 min, to 40% in 5 min with detected wavelength at 222 nm, flow rate was from 0.7 to 1 ml/min, column temperature at 30 ℃. [Result] Three active constituents were baseisolated. The linear ranges of gastrodin, dactylorhin A and militarine were 0.031 34-1.003 mg/ml (R=0.999 8), 0.038 06-1.218 mg/ml (R=0.999 6), 0.039 28-1.257 mg/ml (R=0.999 6) respectively; the average recoveries(n=6) were 98.88%, 99.91% and 100.48% respectively. The content of three AntiAlzheimers active constituents in Tibetan herb Gymnadenia conopsea from fifteen different areas in Tibetan Plateau was determined. [Conclusion] The method is easy and precise which can be used for quantitative analysis of active constituents in Gymnadenia conopsea rapidly. The content of three active constituents changed at a great degree in different species and area.

Key words RPHPLC; Gymnadenia conopsea; Gastrodin; dactylorhin A; militarine; Content determination

手掌參(Gymnadenia conopsea R.Br.)是常用珍稀藏藥,味甘、性溫,具有增力生精、溫腎暖腎、大補(bǔ)元?dú)夂桶采裨鲋堑裙πВ哂泻芨叩乃幱脙r值[1]。天麻素、dactylorhin A和militarine是手掌參中抗AD活性成分的主要有效成分之一[2-4]。由于手掌參入藥品種繁多,各地藥材品質(zhì)有較大差異,同時藥材有效成分也受海拔、土壤、日照和降水量等環(huán)境因素的影響[5]。為了有效控制藥材的質(zhì)量,試驗(yàn)以天麻素、dactylorhin A和militarine為有效藥用指標(biāo)成分,建立青藏高原不同地區(qū)手掌參中抗AD活性成分的含量測定的高效液相色譜分析方法,以期為手掌參原藥材的質(zhì)量控制及制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1.1 研究對象。手掌參,經(jīng)鑒定為Gymnadenia conopsea R.Br.。

1.1.2 主要儀器。FZ102微型植物試樣粉碎機(jī),購自北京永光明醫(yī)療儀器廠;AL204電子天平,購自Mettler Toledo;Agilent 1200高效液相色譜儀(配置自動進(jìn)樣器,在線脫氣機(jī),四元梯度泵,恒溫柱溫箱,DAD檢測器,Agilent 1200色譜工作站),購自Agilent公司;KQ250B型超聲波清洗器,購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑。對照品天麻素。dactylorhin A和militarine,由課題組分離鑒定,純度>99%;色譜乙腈為高效液相色譜專用試劑,購自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠;磷酸為AR級,購自天津市紅巖試劑廠;水為娃哈哈飲用純凈水,市售。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件。ZORBAX SBC18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,進(jìn)樣10 μl,流動相A為乙腈,流動相B為濃度0.5%磷酸水[5-7];梯度洗脫程序[8-10]見表1,柱溫30 ℃[11],檢測波長222 nm[12-13]。

1.2.2 對照品溶液的制備。分別精密稱取天麻素0.100 3 g,用無水甲醇溶于20 ml容量瓶中;取 0.040 6 g dactylorhin A,用無水甲醇溶于10 ml容量瓶中;再取0.041 9 g militarine,用無水甲醇溶于10 ml容量瓶中作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2.3 供試溶液的制備。精密稱取手掌參樣品粉末1.000 g(過40目篩),置具塞錐形瓶中,精密加入濃度75%的乙醇20 ml,稱定重量,65 ℃超聲提取3 h,放冷后再稱定重量,用濃度75%乙醇補(bǔ)足重量,搖勻,過濾后即得供試品溶液。

1.2.4 方法學(xué)考察。(1)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。取對照品溶液和供試品溶液適量,在上述色譜條件下進(jìn)樣,記錄色譜圖,考察系統(tǒng)適應(yīng)性。(2)線性關(guān)系的考察。分別取4 ml天麻素、6 ml dactylorhin A和6 ml militarine混合于20 ml容量瓶中,充分振蕩,再分別取10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 ml上述母液,分別定容于10 ml容量瓶中,得一系列不同濃度的對照品溶液。每次進(jìn)樣10 μl,以濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo),峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),繪制3個成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算3個組分的回歸方程。(3)精密度考察。取天麻素、dactylorhin A和militarine的混合對照品,連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣10 μl,計(jì)算峰面積的RSD。(4)穩(wěn)定性考察。精密吸取供試液溶液10 μl,分別在0、2、4、6、12和16 h重復(fù)進(jìn)樣6次,測定天麻素、dactylorhin A和militarine色譜峰面積的RSD。(5)重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批手掌參樣品,均勻混合后精密稱取6份,每份1.000 g,按“1.2.3”項(xiàng)下制備,分別進(jìn)樣10 μl,記錄峰面積,并計(jì)算含量和RSD。(6)回收率試驗(yàn)。精密稱取已測知含量的手掌參樣品1.000 g共9份,分為3組,每組3份,分別添加低、中、高3種濃度的對照品,按“1.2.3”項(xiàng)下操作,測得平均回收率(n=9)和RSD。

1.2.5 樣品測定。按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備的青藏高原不同地區(qū)手掌參樣品,以“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析,以峰面積為標(biāo)準(zhǔn)按外標(biāo)法計(jì)算青藏高原不同地區(qū)手掌參樣品中天麻素、dactylorhin A和militarine的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察 (1)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。圖1~2表明,在此色譜條件下,對照品溶液和供試品溶液中3個有效成分的分離效果良好,各峰間無干擾。(2)線性關(guān)系的考察。由表2可知,在各自的有效范圍內(nèi),3個有效成分的濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。(3)精密度考察。計(jì)算得天麻素峰面積的RSD為0.16%,dactylorhin A的峰面積的RSD為0.32%,militarine的峰面積的RSD為0.89%;表明精密度良好。(4)穩(wěn)定性考察。計(jì)算得天麻素、dactylorhin A和militarine面積RSD分別為1.02%、0.69%和1.39%,表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。(5)重復(fù)性試驗(yàn)。計(jì)算得天麻素的平均含量為2.198 4 mg/g,RSD為0.61%,dactylorhin A的平均含量為2.634 9

3.3 流動相的選擇 試驗(yàn)用無水甲醇-水、乙腈-濃度0.5%磷酸水溶液、乙腈-水溶液作為流動相,結(jié)果顯示乙腈濃度0.5%磷酸水溶液為流動相時樣品中天麻素、dactylorhin A和militarine分離效果及峰形均較好。

3.4 結(jié)論 筆者分別對15批青藏高原不同地區(qū)不同種屬手參中的天麻素、dactylorhin A和militarine進(jìn)行了含量測定。測定結(jié)果表明,各地區(qū)3種活性成分的含量差異較大,其中玉樹角盤蘭中dactylorhin A和militarine的含量較低,互助北山林場的變異手參各成分的含量均較高,具有較好的藥用價值。試驗(yàn)用反相高效液相色譜法同時測定藏藥手參中天麻素、dactylorhin A和militarine的含量,操作簡便、快速、可靠,可為藏藥手參的質(zhì)量控制、資源評價等工作提供依據(jù)。

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