孫亭亭等

摘要 [目的]分離并鑒定魚嗜水氣單胞菌，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析。[方法]從云南某魚場采集發(fā)病魚的病變組織進行細菌分離與培養(yǎng)，并對分離菌株進行初步鑒定、16S rDNA鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。[結(jié)果]分離培養(yǎng)到1株細菌，命名為Ah1305。經(jīng)表型鑒定、生化試驗及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為嗜水氣單胞菌。[結(jié)論]該研究可為快捷、準確檢測魚嗜水氣單胞引起的疾病提供參考。

關(guān)鍵詞 嗜水氣單胞菌；分離鑒定；16S rDNA

中圖分類號 S182；Q93-331 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）13-03907-04

Abstract [Objective] The aim was to isolate and identify Aeromonas hydrophila and establish the phylogeny. [Method] Lesion tissue of fish was collected from a certain farm in Yunnan Province， and then the isolated strain was identified by preliminary identification， 16S rDNA identification and phylogenetic analysis. [Result] The bacteria were isolated and named as Ah1305. Through the morphological identification， biochemical test and 16S rDNA phylogeny analysis， it was identified as Aeromonas hydrophila. [Conclusion] The study can provide reference for quick and accurately test the disease caused by Aeromonas hydrophila.

Key words Aeromonas hydrophila； Isolation and identification； 16S rDNA

致病性嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于氣單胞菌科（Aermonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），是革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓，直或略彎，單個或成雙排列，有極端單鞭毛，固體培養(yǎng)基上有周鞭毛，無莢膜，不形成芽孢，最適生長溫度為28 ℃。嗜水氣單胞菌普遍存在于淡水、海水、污泥、淤泥以及土壤中，是一種人畜共患病的病原?；疾◆~出現(xiàn)爛尾、鰭充血，導致出血性敗血癥和流行性潰瘍綜合癥（EUS）等癥狀[1-2]，近些年來有大量的報道表明嗜水氣單胞菌還可以引發(fā)人類的腹瀉、中毒病、外傷性感染以及敗血癥等病癥[3]，其致病作用已引起公眾的關(guān)注，該菌在國外被作為腹瀉病原菌進行檢測[4-5]。致病菌株除感染魚及人類以外，還可以感染多種動物（如兩棲類、爬行類、鳥類[6]等），給養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生帶來了巨大損失。

筆者從云南某發(fā)病魚場送檢病料中分離到1株細菌，并對其進行表型鑒定及16S rDNA鑒定，以期為魚場該病的檢測與防治提供科學依據(jù)[7-11]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

病料。采集云南省某魚場發(fā)病魚。將發(fā)病癥狀明顯的魚無菌解剖，取病變明顯的肝臟、脾臟及肌肉，4 ℃下保存。

1.1.2

培養(yǎng)基。TSA培養(yǎng)基，購自北京路橋技術(shù)有限責任公司。糖類發(fā)酵等生化管，購自杭州天和微生物試劑有限公司。血液瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.3

主要試劑及儀器。細菌基因組DNA提取試劑盒（DP2001）、多功能DNA純化回收試劑盒（DP1501），購自BIOTEKE公司。TaKaRa rTaq DNA酶、DL2000 Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司。凝膠成像儀、PCR擴增儀，購自BIO-RAD公司，電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1

分離培養(yǎng)。將病魚體表消毒，無菌取病變組織，剪碎研磨。用無菌生理鹽水對病料進行10倍稀釋，分別接種于TSA培養(yǎng)基和血液瓊脂培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)，挑取灰白色發(fā)生溶血的可疑單菌落進行革蘭氏染色。將染色中有陰性短桿菌的菌落在TSA培養(yǎng)基和血液瓊脂培養(yǎng)基上分離與純化。

1.2.2

形態(tài)觀察。將分離純化后的細菌按照常規(guī)方法進行革蘭氏染色并鏡檢。

1.2.3

生理生化試驗。將純培養(yǎng)的分離菌接種于生化培養(yǎng)基，進行各種糖發(fā)酵試驗、精氨酸雙水解酶試驗、硫化氫試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗，28 ℃下培養(yǎng)24～48 h，記錄培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.4

分子生物學鑒定。

（1）引物設計。參照GenBank已發(fā)表的16S rDNA序列設計1對引物，上游引物：27F（5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3），下游引物：1492R（5GGTTACCTTGTTACGACTT3）。引物由上海生工生物技術(shù)工程有限公司合成。

（2）制備模板：將分離菌株用TSA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照細菌DNA提取試劑盒說明書步驟操作，提取細菌總DNA。

（3）PCR反應體系：TaKaRa rTaq（5 U/μl） 0.5 μl、10×PCR Buffer 3 μl、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.5 μl、上游引物0.5 μl（10 pmol/L）、下游引物0.5 μl（10 pmol/L）、模板DNA 2 μl（50 ng）、滅菌雙蒸水21 μl、共30 μl。

PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 8 min，4 ℃保存，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果。

按照DNA純化（膠回收）試劑盒說明書操作步驟對PCR產(chǎn)物進行純化，并送交華大基因測序。

1.2.5

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。用BLAST將分離株的16S rDNA測序結(jié)果與GenBank中登錄的序列進行比對，并選取19株作為參比序列。將分離株序列與參比序列使用軟件DNAMAN進行同源性分析，計算同源性數(shù)值。使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析分離株與參比株的親緣關(guān)系，鑒定分離株的種屬。參比序列的名稱、登錄號、登錄時間、分離來源及分離地區(qū)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性

通過細菌分離，得到1株細菌，命名為Ah1305。在TSA固體培養(yǎng)基上，形成半透明、圓形、中央凸起、邊緣光滑的小菌落，直徑在1 mm左右。在血液瓊脂培養(yǎng)基上形成灰白色的菌落，產(chǎn)生β型溶血圈（圖1）。

2.2 細菌形態(tài)

3 討論

在臨床上魚類的細菌病中，很多具有共同的癥狀（如體表充血、發(fā)紅、潰爛、腹部膨大、腹水等），只依靠臨床癥狀來判斷及治療有很大盲目性，需要通過實驗室診斷才能確診[12]。實驗室鑒定魚類細菌性疾病病原的方法有很多，主要包括生理生化特性鑒定技術(shù)（如用ATB細菌鑒定儀）[13-14] 、免疫學診斷技術(shù)（如間接ELISA）[15-16]、分子生物學方法[17-20]（如LAMP）[21-22]等。PCR檢測方法簡便快捷，已被較多應用于嗜水氣單胞菌的快速檢測。檢測的目的基因也有多種，如溶血素基因[23-24]、氣溶素基因[25]、絲氨酸蛋白酶基因[26]、16S rDNA[27-28]等。

以16S rDNA為目的基因的PCR鑒定方法最為成熟，也取得了較顯著的成果。與表形鑒定、生理生化鑒定等傳統(tǒng)的細菌鑒定方法相比，該方法操作簡便，省時，且避免了傳統(tǒng)生化試驗的不穩(wěn)定性。與針對其他基因的PCR鑒定方法相比，16S rDNA基因具有高度保守性的特點，穩(wěn)定性好，可靠性高。對于混合感染的病例，可做到一次檢測多種病原菌。該方法方便快捷，成本較低，準確性高，對于癥狀相似的疾病能夠做到準確、快速鑒定病原菌，從而指導臨床治療，避免因誤診而造成的損失。

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