倫志明 池玉杰

摘要 [目的]研究碳源和氮源對人工栽培花臉香蘑（Lepista sordida）菌絲生長和多糖產(chǎn)量的影響。[方法]以人工栽培花臉香蘑菌株為研究對象，利用液體培養(yǎng)的方法，通過比較分析菌絲體麥角固醇含量和多糖產(chǎn)量，研究不同碳源和氮源的影響。[結(jié)果]通過比較分析麥角固醇含量結(jié)果顯示，果糖、甘露糖、纖維二糖、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖都可以作為花臉香蘑菌絲體生長的碳源，但相比之下，前三者生長效果更好，選擇果糖作為碳源，多糖產(chǎn)量最高；丙氨酸、甘氨酸、黃豆粉和蛋白胨都可以作為氮源使用，其中以丙氨酸為氮源生長效果最好，以黃豆粉為氮源的多糖產(chǎn)量最高。[結(jié)論]該研究可為花臉香蘑菌絲體的研究與開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 花臉香蘑；人工栽培；碳源；氮源

中圖分類號 S646 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03195-04

Abstract [Objective] The aim is to study the effect of carbon and nitrogen sources on the growth and polysaccharide outputs of artificial Lepista sordida mycelia. [Method] The strain of artificial L. sordida was investigated for carbon and nitrogen nutrition by ergosterol contents and the production of polysaccharide in liquid media. [Result] The result shows that fructose， mannose， cellobiose， sucrose， glucose and maltose can be used as a carbon source for L. sordida strain by analyzing ergosterol contents. And the former three carbon materials are better for mycelia growth in contrast with sucrose， glucose and maltose. In the meantime， we can get the highest polysaccharide yield with fructose as a carbon source. Alanine， glycine， soybean powder and peptone can be used as a nitrogen source. Alanine is best for mycelia growth and bean powder can produce the highest polysaccharide. [Conclusion] The result provides theoretical basis for the study and production of L. sordida mycelia.

Key words Lepista sordida； Artificial cultivation； Carbon sources； Nitrogen sources

花臉香蘑（Lepista sordida）是一種草腐菌，也叫紫晶香蘑、丁香蘑、花臉蘑，屬真菌界（Fungi）擔子菌門（Basidiomycomycota）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）香蘑屬（Lepista）[1]，廣泛分布于河南、遼寧、江蘇、黑龍江、北京、吉林、四川、甘肅、云南、江西、廣東、青海、新疆、內(nèi)蒙古、中國臺灣和中國香港等地[2]，夏秋季生于富含腐殖質(zhì)的山坡草地、農(nóng)田、堆肥、草原及人工栽植的草坪等處，常常形成蘑菇圈。花臉香蘑具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，菌絲體和子實體中蛋白質(zhì)含量都很高，含有18種氨基酸，其中8種人體所必需氨基酸含量豐富[3-5]，而脂肪含量卻較低[6]，還含有豐富的鉀、鈣、鎂及人體抗自由基、抗衰老、抗癌的硒、鍺和鋅等元素[7]，且菌絲發(fā)酵物具有較強的抗氧化、抗腫瘤、抗菌等活性[8-10]，因此，近年來吸引了越來越多的科研人員的關(guān)注?；樝隳⑾阄稘庥?、味道鮮美、顏色靚麗，在民間也頗愛百姓喜愛，然而，由于缺乏成熟的人工栽培技術(shù)而無法進行大規(guī)模商業(yè)化栽培，所以，目前市場銷售上仍依賴于野生資源，也由此導(dǎo)致價格居高不下。在野生花臉香蘑產(chǎn)量較大的黑龍江省齊齊哈爾雙河農(nóng)場，鮮品價格為26～30元/kg，而干品更是高達600元/kg，即便如此，產(chǎn)品依然供不應(yīng)求。相比于野生花臉香蘑高昂的售價和人工栽培技術(shù)的不成熟，花臉香蘑菌絲體卻有著菌種容易分離、菌絲生長速度較快（試管菌種培養(yǎng)生長速度接近平菇）、沒有污染的優(yōu)勢。因此，通過液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體，進行花臉香蘑生理活性及功能性食品與藥品的開發(fā)研究，不失為一條更加快捷有效的途徑。為此，筆者利用人工栽培得到的花臉香蘑子實體，分離得到菌種，對其進行碳源、氮源試驗，通過比較分析不同培養(yǎng)基中菌絲體生長量及菌絲體多糖產(chǎn)量，研究碳源和氮源所產(chǎn)生的不同影響，以期為花臉香蘑菌絲體研究與開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。 花臉香蘑菌株，分離自黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟職業(yè)學(xué)院食用菌研究所人工栽培獲得的子實體。

1.1.2 主要儀器。DKS26恒溫水浴鍋，上海森信試驗儀器有限公司生產(chǎn)；Cary50紫外分光光度計，美國VARIAN公司生產(chǎn)；KUBOTA6900高速冷凍落地式離心機，日本久保田株式會社生產(chǎn)；真空冷凍干燥機LGJ30，北京松源華興科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；FW100高速萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司生產(chǎn)；HANPING FA2004電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；SPX150C培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司生產(chǎn)；Waters e26952998（二級陣列管檢測器）高效液相色譜儀，美國Waters公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑。葡萄糖、果糖、甘露糖、纖維二糖、蔗糖、麥芽糖、蛋白胨、甘氨酸、丙氨酸、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、濃硫酸、無水乙醇、重蒸酚及瓊脂粉等試劑均為國產(chǎn)分析純，市售；麥角固醇標準樣品（純度99%），購自Sigma；甲醇（色譜純）購自美國Fisher公司；黃豆粉購自本地市場。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)。制作PDA培養(yǎng)基，9 cm培養(yǎng)皿中量入15 ml，將存放于4 ℃冰箱中的花臉香蘑試管菌種置于室溫下活化24 h后，接入平板內(nèi)，25 ℃、黑暗條件下靜止培養(yǎng)，待菌絲長滿后備用。

1.2.2 不同碳源液體培養(yǎng)基配制。基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH 6。分別以葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、纖維二糖作為碳源，以不含糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，配制7種液體培養(yǎng)基，250 ml錐形瓶中分裝25 ml，121 ℃滅菌20 min，每種培養(yǎng)基設(shè)置4個重復(fù)，冷卻備用。

1.2.3 不同氮源液體培養(yǎng)基配制?；A(chǔ)培養(yǎng)基配方同“1.2.2”，分別以甘氨酸、丙氨酸、酒石酸銨、尿素、黃豆粉、蛋白胨為氮源，以不含氮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，配制7種液體培養(yǎng)基，250 ml錐形瓶中分裝25 ml，每種培養(yǎng)基設(shè)置4個重復(fù)，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2.4 菌絲體的培養(yǎng)。用打孔器從平板培養(yǎng)的花臉香蘑菌落邊緣打下5個直徑為8 mm的圓形菌塊，接入裝有各種液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，25 ℃、黑暗條件下靜止培養(yǎng)。

1.2.5 菌絲體麥角固醇含量的測定。麥角固醇是真菌細胞膜的組分之一，廣泛存在于真菌而罕見于高等植物中[11]，其含量與真菌生物量之間有著直接的關(guān)系[12]。在試驗研究中，總是需要對于天然基質(zhì)中的真菌生物量進行精確測定，然而，這種測定由于其與基質(zhì)不可能進行物理分離而變得十分困難[13]。麥角固醇在紫外線λmax=282 nm處有吸收值[14]，可以用無水乙醇（4 ℃）提取并用高效液相色譜法（HPLC）進行定量分析[15]。因此，麥角固醇含量被廣泛應(yīng)用于谷物、土壤、菌根、飼料、馬鈴薯產(chǎn)品、菜子油、泥沙、天然濕地、植物和室內(nèi)環(huán)境真菌生物量的測定方面[16]。該試驗中，通過分析檢測菌絲體中麥角固醇含量對花臉香蘑菌絲體生物量進行比較分析。

1.2.5.1 麥角固醇標準溶液的配制。電子天平稱取麥角固醇標準樣品6.5 mg，加入4 ℃無水冷乙醇6.5 ml，使之溶解，配制成濃度為1.0 mg/ml的標準溶液。

1.2.5.2 線性關(guān)系的考察。移液器量取1.0 mg/ml的標準溶液2 ml，加入10 ml離心管中，用2 ml無水乙醇稀釋，制成濃度0.5 mg/ml的標準溶液，依此方法，用4 ℃無水乙醇逐級稀釋，分別配制成濃度為0.100、0.050、0.010、0.005和0.001 mg/ml的標準溶液，以4 ℃無水乙醇為對照，HPLC測定吸收值。檢測條件設(shè)定為：MSC18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），波長282 nm，柱溫25 ℃，流速1 ml/min，注樣量20 μl，純甲醇流動相，運行時間15 min，檢測吸收峰的出現(xiàn)，以標準樣品濃度（Y，μg/ml）為縱坐標，峰面積（X）為橫坐標，繪制麥角固醇標準吸收曲線，計算線性回歸方程。

1.2.5.3 菌絲體麥角固醇的提取與含量測定。菌絲體培養(yǎng)15 d后，用尼龍膜過濾（孔徑24×30 μm），再用蒸餾水洗滌2次，收集于10 ml離心管中，冷凍干燥24 h；將冷凍干燥后的菌絲體移入研缽，加入4 ℃無水冷乙醇3 ml，研磨菌絲體成為均勻的糊狀；將糊狀液移入1個10 ml離心管中，再用0.5 ml無水冷乙醇洗濯研缽，洗滌物一并裝入離心管中，12 000 r/min離心5 min；將上清液移出，沉淀物加入1.0 ml無水冷乙醇（4 ℃），懸振40 s，12 000 r/min離心5 min，合并上清液，按上述方法用HPLC在282 nm處檢測吸收峰，按下式計算麥角固醇含量：麥角固醇含量（μg/培養(yǎng)容器）=C×V，式中，C為按照回歸方程計算得到的麥角固醇濃度（μg/ml），V為無水乙醇提取液容積（ml）。2.3 氮源對菌絲體生長的影響

從菌絲生長情況看，不含氮源的液體培養(yǎng)基（對照）與酒石酸銨培養(yǎng)基中菌絲生長情況一般；含蛋白胨培養(yǎng)基中，菌絲生長較好；添加黃豆粉、甘氨酸、丙氨酸的培養(yǎng)基中，菌絲生長良好，在黃豆粉培養(yǎng)基中，菌絲呈現(xiàn)明顯的紫色，且有很濃的蘑菇氣味，此種現(xiàn)象在其他碳源和氮源培養(yǎng)基中都未出現(xiàn)；添加尿素的培養(yǎng)基中，觀察不到菌絲生長的現(xiàn)象。

從圖5可以看出，在丙氨酸作為氮源的培養(yǎng)基中生長的菌絲，麥角固醇含量最高，且統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，與其他各培養(yǎng)基相比，存在顯著性差異；其次為甘氨酸，再次為黃豆粉，二者差異不顯著；以蛋白胨作氮源，菌絲體生物量不及前三者，但好于酒石酸銨；對照中不含有氮源，但有葡萄糖，所以菌絲也有生長，與酒石酸銨生長量沒有顯著差異；尿素培養(yǎng)基中，菌絲生物量最低，甚至遠低于對照，這可能是由于培養(yǎng)基配制過程中，經(jīng)過高壓滅菌，尿素產(chǎn)生了有害物質(zhì)，而且是液體培養(yǎng)，直接與菌絲接觸，使某些菌絲中毒死亡，才導(dǎo)致這種結(jié)果的出現(xiàn)。所以，從菌絲體生物量數(shù)據(jù)比較結(jié)果上看，丙氨酸、甘氨酸、黃豆粉和蛋白胨都可以作為氮源使用，其中丙氨酸生長效果最好，而尿素則不適于用作液體培養(yǎng)中的氮源。

2.4 碳源對菌絲體多糖含量的影響

從圖6可以看出，各種碳源培養(yǎng)基中生長的菌絲體多糖含量都高于對照，統(tǒng)計分析結(jié)果表明差異顯著；多糖含量最高的是含果糖培養(yǎng)基，與其他各培養(yǎng)基之間存在顯著性差異；其次為含麥芽糖培養(yǎng)基，再次為含纖維二糖培養(yǎng)基，但二者之間差異不顯著；含甘露糖與蔗糖培養(yǎng)基多糖產(chǎn)量低于含纖維二糖培養(yǎng)基，但三者之間沒有顯著性差異；各種碳源培養(yǎng)基相比較，添加葡萄糖的培養(yǎng)基菌絲體多糖產(chǎn)量最低，然而，從統(tǒng)計分析結(jié)果上看，與含甘露糖和蔗糖培養(yǎng)基差異卻不顯著。所以，該試驗條件下，選擇果糖作為碳源進行菌絲體液體培養(yǎng)，多糖產(chǎn)量最高。

3 結(jié)論

該研究以人工栽培的花臉香蘑分離獲得的菌株為研究對象，采用液體培養(yǎng)的方法，對菌絲體進行碳源和氮源利用能力試驗，通過比較分析菌絲體麥角固醇含量和多糖含量，研究不同碳源和氮源對菌絲體生長和多糖含量的影響。通過比較分析麥角固醇含量結(jié)果顯示，果糖、甘露糖、纖維二糖、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖都可以作為花臉香蘑菌絲體生長的碳源，但相比之下，果糖、甘露糖和纖維二糖是更為理想的碳源，而選擇果糖作為碳源，多糖含量則最高。丙氨酸、甘氨酸、黃豆粉和蛋白胨都可以作為氮源使用，添加丙氨酸的培養(yǎng)基中，菌絲生長效果最好，而含有黃豆粉的培養(yǎng)基中，則是多糖含量最高。不論是比較菌絲體生物量，還是分析多糖含量，其結(jié)果都顯示，在液體培養(yǎng)條件下，不應(yīng)該選擇尿素作為氮源。

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