劉艷等

摘 要 通過對實驗室已獲得的1 685個橡膠炭疽病菌T-DNA插入突變體的生物學及致病性測定，從中篩選出15個致病力明顯減弱的突變體，并進行PCR檢測。結(jié)果表明，該基因組中均含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片段。在PDA培養(yǎng)基上，其中2個突變體菌落顏色異常，6個生長速率下降，8個產(chǎn)孢量顯著降低，2個突變體分生孢子形態(tài)異常，2個附著胞形態(tài)異常，3個不能形成附著胞，在洋蔥表皮上，侵染釘形成率顯著降低。

關(guān)鍵詞 膠胞炭疽病菌；突變體；表型分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract To use the promoter trapping vector pCAHPH， constructed by our lab， via Agrobacterium tumifaciens-mediated transformation（ATMT）of Colletotrichum gloeosporioides， an expansion library of 1 685 transformants resisting to hygromycin B was generated. The 15 transformants which reduced greatly in pathogenicity were selected for identification. The mutants were tested with PCR for the insertional sequence. The results showed that all the genomes of the mutants contained the sequence of hph gene. As to the observation of the biological properties of the mutants， it was found that 2 mutants had abnormal color， the colonies of 6 growed slowly， the sporulation of 8 was significantly reduced， the conidium morphology of 2 was abnormal， the appressoria of 2 was abnormal and 3 could not form any appressoria. The formation rate of infection peg decreased significantly in the onion skin cell.

Key words Colletotrichum gloeosporioides； Mutants； Phenotype analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.030

炭疽病是橡膠樹重要病害之一，可由膠胞炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）或尖孢炭疽病菌（Colletorichum acutatum）引起，導致橡膠樹葉片組織壞死或大量脫落，樹體衰弱，從而縮短割膠期限，最終造成橡膠總產(chǎn)量顯著下降。中國每年受害面積在20 000 hm2以上，造成干膠損失近萬噸[1-2]。其中膠胞炭疽病菌具有寄主范圍廣、繁殖速度快等特點，因此，其引起的病害流行速度快，難于防治。

對于炭疽病的遺傳轉(zhuǎn)化，李偉等[3-4]建立了根癌農(nóng)桿菌介導的膠孢炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系；魏小慧等[5-6]進行了橡膠炭疽病菌啟動子捕獲體系的建立，本研究則利用魏小慧建立的體系，進行了突變體庫的構(gòu)建，至今獲得4 547個轉(zhuǎn)化子。李繼鋒等[7]和蔡志英等[8]對橡膠樹炭疽病菌T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建進行了研究，并對其致病缺陷轉(zhuǎn)化子進行篩選；胡彩平等[9]對柱花草炭疽病菌進行了轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化研究。本研究通過致病性的測定從突變體庫中的1 685個突變體中篩選出15個致病性相關(guān)突變體，對這15個突變體的生物學特性及致病性進一步進行測定，明確致病性與生物學特性之間的聯(lián)系，為充分理解突變體致病性喪失的機制和快捷、有效地分離、鑒定橡膠炭疽病菌致病相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 橡膠膠孢炭疽病菌RC-178菌株由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所熱帶特色經(jīng)濟作物病害課題組提供，該菌株分離自云南具有炭疽病癥狀典型的橡膠葉片病斑，具有極強的侵染性和產(chǎn)孢能力。本實驗室前期已構(gòu)建了基于野生型菌株RC-178的T-DNA插入突變體庫，RC-178和突變體菌株均經(jīng)單孢分離和純化后用紙片法保存于-20 ℃冰箱中。用于篩選致病力喪失突變體的接種材料為健康的熱研7-33-97橡膠樹漸退去古銅色的幼嫩葉片。

1.1.2 培養(yǎng)基 用PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)炭疽菌產(chǎn)生分生孢子、測定生長速度等，用PDA液體培養(yǎng)基大量培養(yǎng)炭疽菌菌絲。

1.1.3 抗生素及試劑 潮霉素B（HygromycinB）購自德國Roche公司；卡那霉素（Kanamycin）、利福平（Rifampicin）、頭孢霉素（Cefotaxime）、四環(huán)素（Tetracyline）和鏈霉素（Streptomycin）等均購自Sigma公司；Taq DNA聚合酶購自TaKaRa大連公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 致病相關(guān)突變體的篩選 參照李琳[10]的方法，采用健康的幼嫩葉片進行離體接種。在35 cm×45 cm的白色磁盤中鋪2層吸水紙，用水濕透，將嫩葉放在吸水紙上，噴灑水霧于葉片上，葉柄用濕潤的濾紙包住保濕，刺傷半邊葉片，用打孔器取相同大小的菌塊在葉表面?zhèn)谔幗臃N，保鮮膜包住白瓷盤保濕，以刺傷葉片接種同樣大小的無菌PDA培養(yǎng)基為對照。實驗重復3次。48 h后觀察接種葉片感染情況，以接種點出現(xiàn)水漬狀變色認定為已被侵染。3 d后開始觀察發(fā)病情況，7 d后進行病害嚴重度分級。

1.2.2 突變體DNA提取及T-DNA插入的分子檢測

將RC-178菌株和突變體移接于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，7 d后收集分生孢子和菌絲，并將其轉(zhuǎn)入PDA液體培養(yǎng)基中，180 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d，待菌液中出現(xiàn)豐富的菌絲體時，過濾收集菌絲體，于40 ℃烘箱內(nèi)干燥1 d，備用。參照崔昌華[2]的方法，用CTAB法提取各參試菌株的DNA。

1.2.3 突變體的生物學特性研究 觀察篩選出的致病性改變突變體單孢分離物形態(tài)特征和生長發(fā)育過程，記錄菌落顏色、直徑、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、附著胞形態(tài)和侵染釘形成等情況。

（1）菌落生長速率及形態(tài)的觀察。用滅菌鑷子夾取保存在紙袋中的15個突變體及RC178的附帶菌絲紙片，置于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后，用打孔器分別打取直徑為0.5 cm的菌餅，并接種于直徑9 cm平皿的PDA平板中央， 28 ℃恒溫培養(yǎng)，8 d后測量菌落直徑，并記錄菌落的顏色。

（2）分生孢子形態(tài)及產(chǎn)孢量的比較。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用無菌三角玻棒刮除菌絲。置于日光燈下連續(xù)光照培養(yǎng)3 d。在平板上按十字交叉法劃線，沿等分線用直徑為0.6 cm打孔器打取8塊菌餅，將所有菌餅放置于盛有4 mL滅菌水的試管中，用玻璃棒攪拌將孢子刮洗下來，從試管中取孢子懸浮液在顯微鏡下用血球計數(shù)板計算孢子數(shù)目，描述分生孢子形態(tài)及計算產(chǎn)孢量。

（3）孢子萌發(fā)和附著胞的觀察。將分生孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)到1.0×105個/mL，滴在干凈的載玻片上，以濕潤棉花在周圍保濕，放置于吸水飽和的濾紙上，于4、8、12、24 h各觀察1次。

（4）侵染釘形成的觀察。取新鮮洋蔥第2層和第3層內(nèi)表皮，分割成1 cm×1 cm小塊，外側(cè)向上貼在吸水飽和的濾紙上，置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，每皿放8～10塊。將RC-178和突變體分生孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)成4.0×104 個/mL，噴霧或點滴于洋蔥表皮上，每個菌株接7皿。25 ℃黑暗保濕培養(yǎng)，并分別于第8、12、18、24、36、48、72小時各取出1皿，在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)和侵染釘形成情況。以上實驗均重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測定數(shù)據(jù)用SAS軟件進行處理與分析。

2.2 T-DNA的PCR檢測

從15個轉(zhuǎn)化子和含有載體質(zhì)粒AGL-PT的PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)均可擴增到約800 bp的潮霉素片段，而陰性對照野生型菌株RC-178沒有任何條帶（圖1）。表明參試的突變體基因組中確實插入了潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的序列。

2.3 膠胞炭疽菌致病性相關(guān)突變體生物學特性分析

對RC-178及15個致病性相關(guān)突變體進行生長速率、產(chǎn)孢量，分生孢子萌發(fā)率及附著胞形成率測定，并采用數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)軟件進行差異顯著性分析。

2.3.1 致病性相關(guān)突變體生長速率測定及菌落形態(tài)觀察 由表1可以看出，有6個致病力相關(guān)突變體T-0003-3、T-0078-1、T-0261-3、T-0695-1、T-0900-1、T-1103-2的菌落生長速率明顯低于RC-178，分別為0.49、0.51、0.47、0.61、0.50、0.43 cm/d。方差分析結(jié)果顯示，這6個突變體與野生型RC-178菌株生長速度均存在明顯的差異顯著性，由此推測，菌落生長速率的減弱可能是由于T-DNA插入導致突變體代謝紊亂造成的。

突變體的菌落形態(tài)及顏色與野生型RC-178菌株相比也有不同程度的差異，突變體T-0161-2菌絲呈青綠色，T-1103-2菌絲呈青灰色，而RC-178氣生菌絲白色且隨著菌絲的不斷生長逐漸變成黑色（圖2）。部分突變體氣生菌絲白色、稀薄且有自噬現(xiàn)象，培養(yǎng)過程中能分泌黃褐色代謝物。

2.3.2 產(chǎn)孢量及分生孢子形態(tài) 橡膠炭疽菌主要是通過分生孢子侵染并危害橡膠樹，因此，產(chǎn)孢量的多少及形態(tài)變異勢必對其致病性起著舉足輕重影響。從表2可見，T-0990-1、T-0161-2、T-0258-2、T-1103-2產(chǎn)孢量與RC-178產(chǎn)孢量差異不顯著；T-0003-3、T-0129-1、T-1580-1、T-0019-1、T-0010-1、T-0005-3、T-0058-1、T-0695-1這8個突變體產(chǎn)孢量均顯著低于RC-178菌株，其中，T-0003-3和T-0695-1未見產(chǎn)生分生孢子，方差分析結(jié)果顯示，6個突變體與野生型炭疽菌RC-178在產(chǎn)孢能力上存在極顯著差異。

通過顯微鏡觀察并對分生孢子大小進行測量發(fā)現(xiàn)（表2），突變體分生孢子形態(tài)與RC-178相比，也均存在變異。野生型RC-178菌株分生孢子大小為（14.41±0.34）μm×（4.03±0.07）μm，長柱型或長圓型，表面光滑，兩端鈍圓。而突變體分生孢子均顯短粗，呈橢圓形或短棍棒形。方差分析結(jié)果顯示，15個突變體分生孢子長度與野生型RC-178均差異顯著，而突變體T-0258-2、T-0078-1、T-1580-1和T-0058-1分生孢子在寬度上與野生型RC-178無明顯差異。

2.3.3 分生孢子萌發(fā)及附著胞、侵染釘形成觀察

分生孢子萌發(fā)及附著胞形成是炭疽菌侵染寄主過程中非常關(guān)鍵的一步，分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生附著胞才有可能再分化出一系列侵染結(jié)構(gòu)侵染寄主，因此較低的萌發(fā)率或者附著胞形成率同樣可能是致病性降低或者喪失的原因之一。筆者統(tǒng)計了不同菌株的萌發(fā)率及附著胞形成率（表3、圖3）。結(jié)果表明，除T-0078-1孢子萌發(fā)率（84%）及附著胞形成率（75%）與野生型RC-178相似，無顯著差異外，其余14個突變體均較低，而且萌發(fā)率和附著胞形成率與野生型RC-178相比均存在顯著差異。突變體T-0900-1、T-0258-2、T-0129-1、T-1580-1、T-0019-1、T-0010-1、T-0005-3和T-0058-1的孢子萌發(fā)率及附著胞形成率均在15%～62%之間，而T-0990-1、T-0261-3及T-0161-2的分生孢子萌發(fā)率僅為2%，遠遠低于野生型菌株RC-178，其中，突變體T-0990-1和T-0161-2分生孢子僅1%可以產(chǎn)生附著胞，而突變體T-0261-3在整個孢子萌發(fā)實驗中未見任何附著胞產(chǎn)生，很可能是其無致病性的機理之一，有待進一步驗證。

在對侵染釘形成情況觀察過程中發(fā)現(xiàn)，15個突變體侵染釘形成率均低于野生型RC-178，與附著胞形成率相似。

3 討論與結(jié)論

本研究中，大部分致病性相關(guān)突變體在菌落生長速度方面與野生型RC-178差異不顯著，其中8個突變體在產(chǎn)孢量方面均顯著低于野生型RC-178，而且菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)也有一些變異。同時，盡管T-0078-1與野生型RC-178萌發(fā)率及附著胞形成率相似，但T-0078-1的產(chǎn)孢量卻不到野生型RC-178的1%，從而使附著胞形成量的絕對值仍然顯著低于野生型。其它突變體分生孢子萌發(fā)率及附著胞形成率均明顯比野生型RC-178低，其中T-0990-1、T-0261-3和T-0161-2幾乎不能萌發(fā)產(chǎn)生附著胞。這些生物學特性方面的變異，可能直接影響其對寄主的侵染，與Kim和Takano的研究結(jié)果類似[11-12]。由此推測，致病性相關(guān)突變體致病性喪失可能導致部分生物學特性產(chǎn)生變化，但仍需要從分子細胞學及分子生物學方面進行研究加以驗證。

在絲狀真菌功能基因組研究中，通過插入突變法（ATMT）獲得突變體，鑒定突變體表型的變異，分析突變體的基因改變，從而可以了解基因功能[13]。ATMT是其中常用的方法之一，ATMT方法獲得的無致病性突變體的致病性喪失可能是由于T-DNA隨機插入至關(guān)鍵基因造成的[14]。這種致病性的喪失通常也會表現(xiàn)為各種生物學特性的變異，如產(chǎn)孢量減少，萌發(fā)率降低，不能產(chǎn)生附著胞或附著胞不能黑色化等[15-17]。如分離自膠胞炭疽菌無致病性突變體中的cap20基因[18]，就是通過對附著胞形成機制的調(diào)控而影響其致病性的。無致病性突變體的深入研究將可能獲得植物與病原菌之間相互作用的有用信息，為致病機理的研究提供理論依據(jù)。近年來，研究人員根據(jù)T-DNA插入標記己經(jīng)成功地從多種炭疽菌無致病性突變體中獲得致病相關(guān)基因，如CLTAl[19]、PKSI[20]、CPR1[21]、CgDN3[22]等。

突變體的遺傳穩(wěn)定性是突變深入研究的基礎(chǔ)，是相關(guān)功能基因克隆及分析有效性的前提，同時也是進行基因功能研究的有力保障。在本實驗的研究結(jié)果中，15個致病性相關(guān)突變體在生物學特性及致病性方面均表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性，為后續(xù)的致病分子機理研究提供實驗材料。下一步將運用 TAIL-PCR技術(shù)克隆轉(zhuǎn)化子T-DNA側(cè)翼序列， 利用Southern雜交證實T-DNA插入拷貝數(shù)；同時，借助本研究室已開展的膠胞炭疽菌基因組序列的測定，開展相關(guān)基因的克隆與功能分析。

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