吳坤鑫等

摘 要 為明確擬南芥At2g04450啟動子對靶標基因表達的啟動作用，根據(jù)已報道的擬南芥基因組序列設(shè)計合成1對引物，以擬南芥基因組DNA為模板克隆At2g04450上游調(diào)控序列，并與pBAR-GUS中間表達載體相連構(gòu)建植物表達載體p04450p-GUS，采用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的滲透法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，以GUS為報告基因研究該調(diào)控序列的組織表達特異性以及病原菌PstDC3000對該啟動子的誘導(dǎo)表達效果。結(jié)果表明：獲得At2g04450上游調(diào)控序列，該序列不僅具有啟動子活性，并且具有組織特異性，GUS基因主要在根特異表達；病原菌PstDC3000對該啟動子的表達沒有誘導(dǎo)作用。本結(jié)果將為研究At2g04450的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 At2g04450啟動子；GUS活性；組織表達特異性

中圖分類號 Q78 文獻標識碼 A

Molecular Cloning and Activity Analysis of a Promoter of

an Arabidopsis thaliana Gene At2g04450

WU Kunxin1，ZHANG Xiuchun1，CHEN Xiongting1，LIU Zhixin1，PENG Ming1，2*

1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences/Key Laboratory

of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou，Hainan 571101，China

2 Environmental Safety Supervision and Inspection Centre for Genetically Modified Plants and Microorganisms

used in Plants，Ministry of Agriculture，Haikou，Hainan 571101，China

Abstract 5′-UTR of At2g04450 gene was cloned by PCR from Arabidopsis thaliana. To investigate the tissue expression pattern and the possible response to pathogen infection of the cloned regulatory sequence，an expression vector containing this sequence fused with GUS was constructed for transformation into A. thaliana by using agrobacterium-mediated method. Histochemical staining of transgenic A. thaliana showed that GUS reporter gene was predominantly expressed in roots，and the activity of the promoter can not be induced by the PstDC3000. This research will facilitate the study of At2g04450 gene function.

Key words At2g04450 promoter；GUS activity；Tissue specificity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.010

At2g04450命名為AtNUDT6，是分布于擬南芥細胞質(zhì)中的 Nudix水解酶基因[1]。Nudix（Nucleoside diphosphates linked to some moiety X）水解酶是需要Mg2+的一類酶，這類酶的共同特征是含有高度保守的由23個氨基酸殘基組成的Nudix基序（motif/box），廣泛存在于包括病毒、細菌、真核生物在內(nèi)的250多種生物中。細菌和人類Nudix至少具有2大功能，一是清除細胞內(nèi)產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物；二是調(diào)節(jié)各生化途徑的中間代謝產(chǎn)物的積累[1]。

與人類和大腸桿菌相比，植物Nudix水解酶基因家族的研究起步比較晚。擬南芥基因組全序列分析發(fā)現(xiàn)擬南芥至少存在24個Nudix水解酶基因，分布于細胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中。目前對Nudix 水解酶基因家族的了解還不夠充分，甚至在某些認識上存在矛盾。擬南芥第一個Nudix 水解酶基因（AtNUDT1），體外生化分析發(fā)現(xiàn)AtNUDT1是一個NADH焦磷酸化酶，在體內(nèi)生理狀態(tài)下表現(xiàn)為具有對葉酸前體物質(zhì)和（脫氧）核苷三磷酸的水解酶活性，表明AtNUDT1是一個雙功能酶[2-3]。Ogawa等[4]研究顯示，AtNUDT2、AtNUDT6、AtNUDT7和AtNUDT10 在體外實驗中均可水解ADP-ribose和NADH，且過量表達AtNUDT2能增強擬南芥的抗氧化能力[4]。Bartsch等[5]的研究結(jié)果也提示，AtNUDT2、AtNUDT6、AtNUDT7 和AtNUDT10 可以通過水解細胞內(nèi)ADP-ribose 從而減少游離ADP-ribose對細胞的傷害作用，但它們在植物體內(nèi)的實際作用還有待于進一步研究。

哺乳動物中NUDT6被證明能夠調(diào)節(jié)纖維原細胞生長因子的表達[6]，并且還可能通過對生長信號的反應(yīng)來調(diào)節(jié)增值[7]。Ishikawa等[8]研究表明擬南芥AtNUDT6在轉(zhuǎn)錄后水平受綠茶兒茶酸的負調(diào)控，但在依賴于NPR1的水楊酸信號傳導(dǎo)途徑中起正調(diào)控作用。目前尚未見At2g04450啟動子活性分析的相關(guān)報道。本研究從擬南芥中獲得At2g04450上游調(diào)控序列，并以它驅(qū)動GUS基因的表達，明確其對靶基因表達的啟動作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞生態(tài)型為本實驗室保存。

1.1.2 藥品與試劑 pMD18-T vector 購自TaKaRa公司；分子生物學(xué)實驗用各種限制性內(nèi)切酶、連接酶等購自Promaga公司；生化試劑購自Sigma公司；大腸桿菌（E. coli）DH5α、 根癌農(nóng)桿菌（Agrob-acterium tumefaciens）GV3101、 載體pBAR-GUS、 病原菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（PstDC3000）為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 At2g04450啟動子的分離、克隆和測序 采用試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取高純度擬南芥基因組DNA，具體按試劑盒說明書進行。根據(jù)GenBank序列（登錄號：CP002685.1），設(shè)計At2g04450上游非編碼區(qū)的特異引物04450p-F： TCAAAGATACCGGACTGTGGAAGC和04450p-R： AACTAGTCCATATTCTAAGAAAACCCAAGTTC（圖2），以擬南芥基因組DNA為模板，進行PCR擴增。將PCR擴增產(chǎn)物連接到pMD18-T質(zhì)粒，按Sambrook等[9]方法，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)篩選獲得重組質(zhì)粒。采用用ABI Prism 377測序儀進行測定。利用數(shù)據(jù)庫PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp）和PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動子調(diào)控元件進行預(yù)測分析。

1.2.2 04450p：：GUS植物表達載體的構(gòu)建 克隆的04450p啟動子片段用AgeI和SpeI進行雙酶切，將釋放出的外源片段與經(jīng)AgeI和SpeI雙酶切的載體pBAR-GUS相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，搖菌并抽提質(zhì)粒。將酶切鑒定正確的克隆用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株中。

1.2.3 擬南芥轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化方法采用花序浸泡法[10]，抗性植株的篩選參照張秀春等[11]進行。

1.2.4 抗性植株P(guān)CR檢測 采用NaOH法快速提取抗性植株基因組DNA，以葉片基因組DNA為模板，BAR-219F（GGTCTGCACCATCGTCAACCACTA

CA）和BAR-671R（GGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCC

AGAA）為引物，PCR反應(yīng)體系參照產(chǎn)品說明書進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 病原菌的培養(yǎng)和接種 病原菌的培養(yǎng)按Whalen等[12]方法進行。將培養(yǎng)好的病原菌以10 mmol/L MgCl2稀釋至OD600=0.1，用沒有針頭的注射器器口緊貼葉片背面，然后用力緩慢推注射器使菌液完全注入右半片葉子，直到注射的右半葉片濕潤為止。本研究以8個獨立的轉(zhuǎn)基因株系為試驗材料，重復(fù)3次。每株系接6個重復(fù)（6棵），每個重復(fù)接種3片葉子，分別取注射1、5、24 h后的葉片進行GUS活性的組織化學(xué)染色分析，以注射10 mmol/L MgCl2的葉片為對照。

1.2.6 GUS活性的組織化學(xué)染色分析 種植T3代純合植株，分別取不同時期及不同組織的材料進行GUS染色[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 At2g04450基因啟動子片段的擴增

以擬南芥Col-0生態(tài)型的總基因組DNA為模板，用特異引物04450p-F和04450p-R進行PCR擴增獲得1 405 bp的At2g04450上游調(diào)控序列（圖1-a），命名為04450p。將擴增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后在含X-Gal和IPTG的固體LB培養(yǎng)基上進行重組子的篩選，并對其中1個白斑用AgeI和SpeI進行酶切鑒定，結(jié)果如圖1-b所示，待鑒定質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物與預(yù)期大小相同，將該重組質(zhì)粒命名為pMD18-04450p。pMD18-04450p序列分析表明，克隆的04450p與GenBank中登錄的序列（登錄號：CP002685.1）一致。

2.2 植物表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

用AgeI和SpeI酶切重組質(zhì)粒pMD18-04450p，回收1 400 bp左右的目的片段，并插入到pBAR-GUS載體的GUS報告基因上游，所得重組質(zhì)粒經(jīng)AgeI和SpeI進行雙酶切鑒定，獲得預(yù)期大小的目的片段，結(jié)果如圖2所示，經(jīng)鑒定的重組子命名p04450p-GUS。通過凍融法，將獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株，提取質(zhì)粒并經(jīng)AgeI和SpeI雙酶切驗證（圖略）后用于擬南芥轉(zhuǎn)化。

2.3 抗性植株P(guān)CR檢測

用滲透轉(zhuǎn)化法，將p04450p-GUS轉(zhuǎn)入擬南芥，經(jīng)除草劑抗性篩選獲得33株抗性植株。以BAR-219F和BAR-671R為引物，對抗性植株進行PCR檢測，部分結(jié)果如圖3所示。其擴增結(jié)果均與質(zhì)粒p04450p-GUS的擴增結(jié)果相同，在250～500 bp之間出現(xiàn)一條明亮條帶，大小與預(yù)期一致，證明此抗性植株均含有bar基因片段，獲得了轉(zhuǎn)基因04450p：：GUS植株。

2.4 At2g04450啟動子在不同組織中的活性分析

將篩選出的轉(zhuǎn)基因04450p：：GUS植株T3代純合子進行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果表明野生型擬南芥（對照）幼苗和花序（圖4-a，4-f）沒有GUS表達，而轉(zhuǎn)基因04450p：：GUS植株的表達情況（圖4-c～e， h～j）與CaMV35S[14]（圖4-b， 4-g）、AtNUDT8[15]、AtNUDT5[16]等組成型表達啟動子完全不同，表現(xiàn)為2周大的轉(zhuǎn)基因幼苗葉片除在頂端和兩側(cè)的3點外其余部位均沒有檢測到GUS信號（圖4-c， 4-d），而根部只有側(cè)根中間部分檢測到GUS表達信號（圖4-j），但是在蓮座葉（圖4-e）、整個花序（圖4-h）、果莢（圖4-i）沒有檢測到GUS表達信號。本結(jié)果顯示，所分離克隆的片段具有啟動子功能并且有一定的組織特異性。

2.5 病原菌PstDC3000對At2g04450啟動子的誘導(dǎo)表達分析

病原菌PstDC3000的誘導(dǎo)表達分析如圖5所示，與已報道的受病原菌誘導(dǎo)的04430p：：GUS轉(zhuǎn)基因植株GUS表達量隨著誘導(dǎo)時間的增加而加強不同[17]，病原菌PstDC3000 誘導(dǎo)1、5、24 h 后的04450p：：GUS轉(zhuǎn)基因植株GUS的表達與注射10 mmol/L MgCl2 24 h后的對照并沒有區(qū)別，均沒有GUS活性，說明病原菌PstDC3000 對At2g04450 啟動子驅(qū)動的GUS表達沒有誘導(dǎo)作用。

3 討論與結(jié)論

本研究中At2g04450啟動子在不同組織中的活性分析結(jié)果顯示，該啟動子的活性在根中明顯高于其他部位，這與Ogawa等[1]的研究報道At2g04450在根中的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于莖和葉不同，其原因可能是由于培養(yǎng)條件不同所致。Jambunathan等[17]報道野生型擬南芥（Col-0）的AtNUDT2，AtNUDT6和 AtNUDT7在營養(yǎng)豐富程度不同的培養(yǎng)基質(zhì)中表達水平有所差異。

病原菌PstDC3000對At2g04450啟動子的誘導(dǎo)表達分析結(jié)果顯示，該病原菌對At2g04450啟動子沒有誘導(dǎo)作用，該結(jié)果與Adams-Phillips等[18]報道的病原菌PstDC3000對擬南芥At2g04450基因的表達沒有誘導(dǎo)作用相一致。此外，其與該序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果相吻合，在04450p序列中除包含基本的啟動元件及大量的CAAT盒外，還包含MBS元件（干旱誘導(dǎo)相關(guān)）、HSE元件（熱脅迫相關(guān)）以及與光響應(yīng)有關(guān)的ACCT-motif、GAG-motif、 TCT-motif、G-box及MRE元件（圖6），表明該序列不僅具有啟動子活性，而且還可能具有多重因子的誘導(dǎo)活性。但是該啟動子缺乏與病原菌誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件GCC 類元件和W-boxes元件[19-20]等。W-box[（T）TGAC（C/T）]是植物特有的超基因家族WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。越來越多的證據(jù)表明，W-boxes是許多病原誘導(dǎo)植物基因的主要順式作用元件。串連排列的W-box往往與病原的誘導(dǎo)特性有關(guān)。

本研究成功地克隆擬南芥At2g04450的啟動子04450p，并與pBAR-GUS相連構(gòu)建了植物表達載體p04450p-GUS，采用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的滲透法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，通過除草劑篩選獲得了一批抗性純合子轉(zhuǎn)基因植株。然后對轉(zhuǎn)基因植株2周幼苗進行GUS活性的組織化學(xué)染色分析，并對3.5～4周的轉(zhuǎn)基因植株葉片進行病原菌誘導(dǎo)表達分析。結(jié)果顯示該啟動子具有一定的組織特異性，并且病原菌PstDC3000對該啟動子的表達沒有誘導(dǎo)作用。本研究將為擬南芥At2g04450的功能研究提供參考。

參考文獻

[1] Ogawa T， Ueda Y， Yoshimura K， et al. Comprehensive analysis of cytosolic Nudix hydrolases in Arabidopsis thaliana[J]. Biol Chem， 2005， 280（26）： 25 277-25 283.

[2] Klaus S M J， Wegkamp A， Sybesma W， et al. A nudix enzyme removes pyrophosphate from dihydroneopterin triphosphate in the folate synthesis pathway of bacteria and plants[J]. J Biol Chem， 2005， 280（7）： 5 274-5 280.

[3] Dobrzanska M， Szurmak B， Wyslouch-Cieszynska A， et al. Cloning and characterization of the first member of the Nudix family from Arabidopsis thaliana[J]. J Biol Chem， 2002， 277（52）： 50 482-50 486.

[4] Ogawa T， Ishikawa K， Harada K， et al. Overexpression of an ADP-ribose pyrophosphatase， AtNUDX2， confers enhanced tolerance to oxidative stress in Arabidopsis plants[J]. Plant J， 2009， 57（2）： 289-301.

[5] Bartsch M， Gobbato E， Bednarek P， et al. Salicylic acid-Independent ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1 signaling in Arabidopsis Immunity and cell death Is regulated by the monooxygenase FMO1 and the nudix hydrolase NUDT7[J]. Plant Cell， 2006， 18（4）： 1 038-1 051.

[6] Zhang S C， Barclay C， Alexander L A， et al. Alternative splicing of the FGF antisense gene： differential subcellular localization in human tissues and esophageal adenocarcinoma[J]. J Mol Med， 2007， 85（11）： 1 215-1 228.

[7] Asa S L， Ramyar L， Murphy P R， et al. The endogenous fibroblast growth factor-2 antisense gene product regulates pituitary cell growth and hormone production[J]. Mol Endocrinol， 2001， 15（4）： 589-599.

[8] Ishikawa K， Yoshimura K， Harada K， et al. AtNUDX6， an ADP-ribose/NADH pyrophosphohydrolase in Arabidopsis， positively regulates NPR1-dependent salicylic acid signaling[J]. Plant Physiol， 2010， 152（4）： 2 000-2 012.

[9] Sambrook J， Fritsch E F， Maniatis T. Molecular cloning： a Laboratory Manual，（2nd ed.）[M]. N Y： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989.

[10] Clough S J， Bent A F. Floral dip： a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. Plant J， 1998， 16（6）： 735-743.

[11] 張秀春， 李文彬， 夏亦薺， 等. At2g04450過量表達的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株[J]. 熱帶生物學(xué)報， 2010， 1（1）： 8-11.

[12] Whalen M C， Innes R W， Bent A F， et al. Identification of Pseudomonas syringae pathogens of Arabidopsis and a bacterial locus determining avirulence on both Arabidopsis and soybean[J]. Plant Cell， 1991， 3（1）： 49-59.

[13] Jefferson R A， Kavanagh T A， Bevan M W. GUS fusions： beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[J]. EMBO J， 1987， 6（13）： 3 901-3 907.

[14] Ruan M B， Liao W B， Zhang X C， et al. Analysis of the cotton sucrose synthase3（Sus3）promoter and first intron in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Sci， 2009， 176（3）： 342-351.

[15] 張秀春， 吳坤鑫， 李文彬， 等. 擬南芥AtNUDT8啟動子的分離及其功能分析[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2012， 33（2）： 316-320.

[16] Zhang X C， Li M Y， Ruan M B， et al. Isolation of AtNUDT5 gene promoter and characterization of its activity in transgenic Arabidopsis thaliana[J]. Appl Biochem Biotechnol. 2013， 169（5）： 1 557-1 565.

[17] Jambunathan N， Penaganti A， Tang Y H， et al. Modulation of redox homeostasis under suboptimal conditions by Arabidopsis nudix hydrolase 7[J]. BMC Plant Biol. 2010， 10： 173.

[18] Adams-Phillips L， Wan J， Tan X， et al. Discovery of ADP-ribosylation and other plant defense pathway elements through expression profiling of four different Arabidopsis-Pseudomonas R-avr interactions[J]. Mol Plant Microbe Interact， 2008， 21（5）： 646-657.

[19] Dong J X， Chen C H， Chen Z X. Expression profiles of the Arabidopsis WRKY gene superfamily during plant defense response[J]. Plant Mol Biol， 2003， 51（1）： 21-37.

[20] Eulgem T， Rushton P J， Schmelzer E， et al. Early nuclear events in plant defence signalling： rapid gene activation by WRKY transcription factors[J]. EMBO J. 1999， 18（17）： 4 689-4 699.