盧協(xié)勤，杜強(qiáng)，高天明，張揚(yáng)，翁曉琴，馮旰珠**

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院1藥劑科；2呼吸科，江蘇南京 210011

熱毒寧對(duì)呼吸道合胞病毒感染哮喘模型小鼠的影響*

盧協(xié)勤1，杜強(qiáng)2，高天明2，張揚(yáng)2，翁曉琴2，馮旰珠2**

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院1藥劑科；2呼吸科，江蘇南京 210011

目的：探討熱毒寧（RDN）對(duì)呼吸道合胞病毒（RSV）感染哮喘加重小鼠氣道炎癥的影響。方法：雌性BALB/c小鼠32只，隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照組、雞卵白蛋白（OVA）組、OVA/ RSV組、OVA/RSV/RDN組。無創(chuàng)肺功能檢測各組小鼠氣道反應(yīng)性；HE染色觀察肺部炎癥變化；小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)并分類；ELISA法檢測BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ含量。結(jié)果：RSV感染能夠加重哮喘小鼠氣道炎癥與氣道高反應(yīng)性，RDN抑制RSV感染哮喘加重小鼠氣道高反應(yīng)性（P＜0.05）；RDN顯著減少RSV感染哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ含量。結(jié)論：RDN可以減輕RSV感染的小鼠氣道炎癥反應(yīng)，抑制氣道高反應(yīng)性。

呼吸道合胞病毒；哮喘；氣道炎癥；熱毒寧

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，氣道炎癥由多種炎性細(xì)胞，如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等參與所致。呼吸道合胞病毒（RSV）感染是導(dǎo)致哮喘急性發(fā)作的重要因素之一，RSV感染導(dǎo)致哮喘氣道炎癥加重，患者激素不敏感[1]。熱毒寧注射液由青蒿、金銀花、梔子3味中藥提取精制而成，是一種抗菌抗炎的中成藥，具有清熱、疏風(fēng)、解毒等功效。本研究應(yīng)用熱毒寧（RDN）干預(yù)RSV感染哮喘小鼠模型后，觀察其對(duì)氣道炎癥和高反應(yīng)性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡的雌性SPF級(jí)BALB/c純系小鼠〔上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可SCXK（滬）2012-0002〕共36只，投放南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)（設(shè)置環(huán)境溫度為25℃，濕度為70%）。使用專用于測定小動(dòng)物的肺功能分析系統(tǒng)AniRes2005分析軟件（北京貝蘭博科技有限公司）；雞血清卵蛋白（OVA，Ⅴ級(jí)，美國Sigma公司）；RSV A亞型原型株Long株由江蘇省人民醫(yī)院呼吸科贈(zèng)予[2]；IL-4和干擾素-γ（IFN-γ）的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；IL-5、IL-13的ELISA檢測試劑盒購自美國ADL公司。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型小鼠的制備和分組隨機(jī)將32只小鼠分為4組，即正常對(duì)照組、OVA組、OVA/RSV組和OVA/RSV/RDN組，每組8只。

動(dòng)物模型制作和分組：（1）OVA組：腹腔注入0．2 mL致敏溶液（包括OVA 100 μg，氫氧化鋁凝膠1 mg），第21天起小鼠霧化吸入1%OVA激發(fā)，每次30 min，每天1次，連續(xù)5天。（2）OVA/RSV組：致敏、激發(fā)同OVA組，第21天鼻腔滴入滴度為1．0× 106空斑形成單位（PFU）的RSV 50 mL。（3）OVA/ RSV/RDN組：致敏、激發(fā)、病毒接種同前組，第21天起接種RSV后腹腔注射RDN 0．2 mL（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：140227），每天1次，連續(xù)5天。（4）正常對(duì)照組：以PBS代替OVA致敏、激發(fā)和RSV鼻腔滴入。

1.2.2 小鼠氣道反應(yīng)性激發(fā)實(shí)驗(yàn)OVA末次激發(fā)小鼠24 h后，用3%戊巴比妥鈉（70 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，行氣管切開、氣管插管，同時(shí)行尾靜脈穿刺置管，將小鼠放入密閉的體描箱中，連接小型動(dòng)物呼吸機(jī)行輔助通氣，動(dòng)物呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為：呼吸頻率90次/min，吸呼比為1．0∶1．5，潮氣量為6 mL·kg-1。每只小鼠分別給予逐漸增加的氯化乙酰膽堿（ACH），濃度為0、10、30、90、270μg·kg-1，采用AniRes 2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)測定氣道阻力[3-4]。

1.2.3 小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞檢測支氣管肺泡灌洗（BAL）4組小鼠，眼眶靜脈采血后行支氣管肺泡灌洗，分3次緩慢注入生理鹽水，每次注入量為0．4 mL，每次灌洗后立即回收置于離心管中，計(jì)量。BAL離心（1000 g，10 min）后細(xì)胞沉渣做瑞士染色并分類，上清液-70℃?zhèn)溆?，行IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13檢測。參照ELISA檢測試劑盒使用說明書檢測BALF中細(xì)胞因子和血清總IgE水平的含量。

1.2.4 小鼠肺組織病理改變?nèi)⌒∈蟮淖笊先~肺組織，使用10%中性福爾馬林液固定，石臘包埋、脫水、切片后進(jìn)行HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠氣道反應(yīng)性的比較

經(jīng)不同濃度的ACH激發(fā)以后，各組小鼠氣道阻力變化見圖1。在ACH濃度為10、30 μg·kg-1時(shí)各組小鼠氣道阻力無顯著性差異（P＞0．05）。當(dāng)ACH的濃度分別為90和270 μg·kg-1時(shí)，OVA/RSV組較OVA組和正常對(duì)照組相比較，小鼠的氣道阻力明顯增加；OVA/RSV/RDN組與OVA/RSV組相比較，小鼠的氣道阻力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖1 各組小鼠氣道反應(yīng)性的比較（±s，n=8）

2.2 各組小鼠BALF中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)

與正常對(duì)照組相比，OVA組和OVA/RSV組BALF總細(xì)胞數(shù)明顯升高，其中OVA/RSV組升高明顯，主要為嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，與OVA組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；OVA/RSV組經(jīng)熱毒寧（RDN）治療后BALF中細(xì)胞總數(shù)以及嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著下降，與OVA/RSV組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見圖2。

圖2 小鼠BALF總細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞分類（±s，n=8）

2.3 HE染色光鏡觀察

正常對(duì)照組小鼠支氣管管腔以及血管周圍未見明顯的炎性細(xì)胞的浸潤。OVA組和OVA/RSV組小鼠支氣管管腔周圍及黏膜下可見大量炎性細(xì)胞的浸潤，肺泡腔內(nèi)可見炎性滲出，其中OVA/RSV組較OVA組更加明顯。而OVA/RSV/RDN組較OVA/ RSV組明顯減輕。見圖3。

圖3 各組小鼠病理結(jié)果的比較（HE染色）

2.4 各組小鼠BALF和血漿中細(xì)胞因子水平的比較

見表1。

3 討論

流行病學(xué)研究表明，呼吸道病毒感染是哮喘急性加重、致死的重要原因之一，因重度哮喘死亡患者的肺標(biāo)本常檢測到呼吸道合胞病毒[5-6]。由于已經(jīng)感染過RSV的成人可以再次被同株的RSV感染，且缺乏有效的治療手段，因此在哮喘的發(fā)病過程中針對(duì)RSV的抗感染研究具有重要意義。

表1 各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13水平比較（±s，n=6）

表1 各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13水平比較（±s，n=6）

*與正常組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）#與OVA/RSV組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

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熱毒寧是臨床上常用的一種兼具抗菌、抗病毒作用的中成藥，具有抗感冒、退熱等作用，其臨床療效表明還具有抗炎、抑制機(jī)體非特異性炎癥、提高機(jī)體抗氧化的能力。國內(nèi)學(xué)者利用熱毒寧治療哮喘模型，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制哮喘模型的氣道炎癥[7]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，與OVA組比較，OVA/RSV組小鼠氣道炎癥、氣道阻力（RL）明顯增加，提示哮喘經(jīng)RSV感染可顯著增加氣道炎癥與氣道高反應(yīng)性，炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類表明中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多；BALF中Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13明顯升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Th1細(xì)胞因子IFN-γ也顯著升高。使用熱毒寧治療后發(fā)現(xiàn)，RSV感染誘導(dǎo)加重的氣道炎癥與氣道高反應(yīng)性得到明顯的減輕，提示熱毒寧對(duì)于哮喘感染RSV具有較好的治療價(jià)值。

總之，本研究結(jié)果提示熱毒寧能夠顯著抑制RSV誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型的氣道炎癥、降低氣道高反應(yīng)性。具體的機(jī)制有待今后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明。

[1] Bera MM,Lu B,Martin TR,et al.Th17 cytokines are critical for respiratory syncytial virus-associated airway hyperreponsivenessthroughregulationbycomplement C3a and tachykinins[J].J Immunol,2011,187(8): 4245-55.

[2] Jiang XB,Huang M,Cui XF,et al.Respiratory syncytial virus infection differentiates airway dysfunction in the central and peripheral airways in OVA-sensitized mice[J].Exp Lung Res,2012,38(9-10):453-62.

[3] Zha WJ,Qian Y,Shen Y,et al.Galangin Abrogates Ovalbumin-Induced Airway Inflammation via Negative Regulation of NF-κB[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:767689.

[4] Du Q,Gu X,Cai J,et al.Chrysin attenuates allergic airwayinflammationbymodulatingthetranscription factors T-bet and GATA-3 in mice[J].Mol Med Rep, 2012,6(1):100-4.

[5] Teichtahl H,Buckmaster N,Pertnikovs E.The incidence of respiratory tract infection in adults requiring hospitalization for asthma[J].Chest,1997,112(3):591-6.

[6] O'Sullivan S,Cormican L,Faul JL,et al.Activated cytotoxic CD8+T lymphocytes contribute to the pathology of asthm a death[J].Am J Respir Crit Care Med, 2001,164(4):560-5.

[7] 范廣民，葉斌，李紹波，等.熱毒寧注射液對(duì)哮喘大鼠肺組織病理改變及TRAF2表達(dá)的調(diào)控作用[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，22（1）：3-5.

Effect of Reduning on Respiratory Syncytial Viruses Induced Airway Inflammation and Asthma Exacerbation in Mice*

LU Xie-qin1,DU QIANG2,GAO Tian-ming2,ZHANG Yang2,WENG Xiao-qin2,FENG Gan-zhu2**1Department of Pharmacy;2Department of Respiration,the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical U-niversity,Nanjing Jiangsu 210011,China

Objective：To evaluate the effect of Reduning(RDN)on respiratory syncytial virus(RSV)-induced airway inflammation and asthma exacerbation in Balb/c mice.Methods：Thirty-two female mice were randomly divided into 4 groups(n=8 for each group):control group,OVA(ovalbumin)group,OVA/ RSV group and OVA/RSV/RDN group.Airway responsiveness was assessed using a whole body plethysmography.Lung histopathological changes were evaluated by HE stain.Cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)were counted and classified,the supernatants of the BALF were used for detection of interleukin (IL)-4,IL-5,IL-13 and interferon(IFN)-γ.Results：RSV infection induced airway inflammation and airway hyper-responsiveness(AHR)exacerbation.Administration of RDN remarkably inhibited airway inflammation and AHR.IFN-γ,IL-4,IL-5 and IL-13 levels in BALF decreased in OVA/RSV/RDN group compared with OVA/RSV group(P<0.01,respectively).Conclusion：RDN might suppress airway inflammation and AHR in RSV infected asthmatic mice.

Respiratory syncytial viruses;Asthma;Airway inflammation;Reduning

R965.1

A

1673-7806（2014）06-499-03

江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金臨床藥學(xué)科研課題（奧賽康基金課題）（P200960）；江蘇省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目（LZ13228）；南京市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目（YKK13176）

盧協(xié)勤，男，副主任藥師 E-mail:luxieqin@sohu.com

* *通訊作者 馮旰珠，男，主任醫(yī)師 E-mail:zhu1635253@163.com

2014-07-30

2014-10-01