倪立，初亞男，張婕妤，周國華

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥理科，南京 210002

CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性對華法令抗凝治療維持劑量的影響*

倪立，初亞男，張婕妤，周國華

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥理科，南京 210002

目的：研究細(xì)胞色素P450 2C9基因（CYP2C9）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物1基因（VKORC1）在華法令抗凝治療患者的多態(tài)性分布，并探討其對抗凝劑量的影響。方法：收集74例服用華法令抗凝治療病人的外周血，測定其凝血酶原時間國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）和CYP2C9、VKORC1基因類型，探討基因多態(tài)性的分布特點，以及華法令維持劑量與基因多態(tài)性的關(guān)系。結(jié)果：CYP2C9基因分布主要為野生型，突變型較少，抗凝治療的維持劑量野生型組與突變組無明顯差別。VKORC1基因型的分布AA型為主，AG型較少，GG型未見，抗凝治療的維持劑量AG組明顯高于AA組。結(jié)論：CYP2C9、VKORC1基因在中國漢族人群中具有遺傳多態(tài)性，VKORC1基因的多態(tài)性在華法令抗凝治療中具有顯著意義。

CYP2C9；VKORC1；基因多態(tài)性；華法令；INR

1 資料和方法

華法令是一種香豆素類口服抗凝藥，具有抗凝和溶栓的雙重作用，但由于華法令抗凝治療窗窄，使用不當(dāng)容易引起出血或栓塞。華法令臨床使用的穩(wěn)定劑量常常受到飲食、疾病狀態(tài)、聯(lián)合用藥及基因等因素的影響，其中與基因相關(guān)因素的影響近年來研究較多，目前受關(guān)注較多的基因中有細(xì)胞色素P450 2C9（CYP2C9）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物1（VKORC1）[1-2]。了解其分布特點及對華法令維持劑量的影響，有助于華法令個體化合理使用。

1.1 研究對象

收集2013年～2014年在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院就診的因各種原因服用華法令抗凝的患者74例，其中男性52例，女性22例，年齡20～78歲，肝腎功能正常。在臨床醫(yī)師指導(dǎo)下服用華法令，檢測凝血酶原時間國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR），并根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整用藥劑量至抗凝維持劑量。同時測定CYP2C9、VKORC1的基因類型。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本采集及處理在患者知情同意的前提下，收集外周血5 mL（EDTA-Na2抗凝）。

1.2.2 凝血酶原時間國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）測定采血后30 min內(nèi)3000 r·min-1離心15 min，檢測INR。儀器為自動凝血儀，由本院檢驗科測定。

1.2.3 基因測序

主要試劑Wizard?基因組DNA提取試劑盒（Promega公司）；TaqTMDNA聚合酶試劑盒（TaKaRa公司）；引物（英駿合成）；ProMark Gold Q96試劑盒（QIAGEN公司）。

主要儀器基因擴(kuò)增儀（朗基）；PyroMark Q24真空工作站（QIAGEN公司）。

PCR擴(kuò)增引物序列見表1。其中一條引物5’經(jīng)生物素（Biotin）修飾。采用50 μL PCR體系：10× PCR buffer 5 μL、MgCl23 μL、dNTP Mixture 4 μL、10 μmol·L-1正反引物各2 μL、蒸餾水32.15 μL、Taq酶0.25 μL、基因組DNA 2.5 μL。反應(yīng)條件：CYP2C9*2和CYP2C9*3位點使用的PCR程序：94℃5 min，35 cycles（94℃30 s、55℃30 s、72℃30 s），72℃7 min。VKORC1位點使用的PCR程序：94℃5 min，35 cycles（94℃30 s、65℃30 s、72℃30 s），72℃7 min。

焦磷酸測序使用PyroMark Q24真空工作站進(jìn)行單鏈制備和焦磷酸測序過程。退火引物序列見表2。退火程序：80℃30 s，室溫冷卻至少5 min。

表1 目的基因擴(kuò)增引物序列

表2 目的基因退火引物序列

2 結(jié)果

2.1 基因型分布

在進(jìn)行CYP2C9基因型測定時，檢測了*2*3等位基因的突變情況，其中*2突變雜合型6例，*3突變型3例，同時含*2*3突變1例，因為同是CYP2C9基因突變表現(xiàn)，所以合并統(tǒng)計。在觀察的74例患者中CYP2C9野生型64例，CYP2C9*2或*3突變型10例。VKORC1基因型及等位基因檢測結(jié)果，在觀察的74例患者中VKORC1野生型（AA）61例，VKORC1突變AG型13例，VKORC1突變GG型0例，見表3。

表3 不同種族基因頻率分布情況

由于不同種族的基因表現(xiàn)存在著多態(tài)性，所以將研究結(jié)果與高加索人[1，3-4]及其它漢族人群研究結(jié)果[1，5]進(jìn)行了對比，結(jié)果見表3。從表3可以看出，漢族人的CYP2C9基因分布與高加索人相似，大多數(shù)人為野生型；但VKORC1基因型的分布情況不同，漢族人以AA型為主，AG型較少，GG型罕見，而高加索人以AG為主，AA型較少。

2.2 基因多態(tài)性與劑量的關(guān)系

分別以CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性為依據(jù)進(jìn)行分組，以INR為抗凝治療的療效指標(biāo)，對各組華法令維持劑量進(jìn)行統(tǒng)計，并進(jìn)行組間t檢驗，各組病數(shù)、抗凝療效（INR）和維持劑量見表4。從統(tǒng)計結(jié)果看出，CYP2C9兩組間臨床維持劑量沒有明顯差異。VKORC1中兩組比較，在AG組INR值低于AA組的情況下，華法令的維持劑量AG組仍明顯高于AA組，兩組間均值進(jìn)行t檢驗，t=2.5182，2.030（t0.05）<2.5182（t）<2.724（t0.01），因此0.01

表4 基因多態(tài)性對華法令抗凝治療的影響（±s）

表4 基因多態(tài)性對華法令抗凝治療的影響（±s）

*與VKORC1野生型（AA）型組相比，有顯著差異，0.01＆lt;P<0.05。

?

3 討論

華法令是目前臨床廣泛使用的口服抗凝藥，研究表明,不同患者的劑量可以相差20倍，造成臨床維持劑量差異的原因有多種，其中遺傳因素是引起個體差異的主要原因之一。近年來的研究表明，CYP2C9和VKORC1是對華法令劑量具有顯著影響的兩個基因組，也是華法令療效研究中備受關(guān)注較多的兩個基因組[1-2]。比較了CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性分布在不同種族之間的表現(xiàn)，在高加索人中CYP2C9基因頻率分布以野生型為主，突變型少見[1，3-4]。在本研究收集的74例病例中，CYP2C9野生型64例，分布頻率為86.5%，突變型10例，分布頻率為13.5%，其它以漢族為目標(biāo)的研究中CYP2C9基因頻率分布也相似[1，5]。VKORC1基因在高加索人頻率分布以AG+GG型為主（85.8%），AA型相對較少（14.2%），而漢族人VKORC1基因多態(tài)性分布以AA為多[1，5]。在本研究收集的74例病例中，AA型61例，分布頻率為82.4%，AG型13例，分布頻率為17.6%，GG型0例。其它以漢族為目標(biāo)的研究中AA型分布頻率為82.1%，AG+GG型分布頻率為17.9%[1，5]，與本研究結(jié)果相近。從上述研究看出，漢族人與高加索人在CYP2C9基因多態(tài)性分布頻率上沒有顯著差異，但在VKORC1基因多態(tài)性分布頻率上漢族人與高加索人有明顯不同，漢族人群中以野生型AA為主（82.2%），而高加索人以突變型AG+GG為主（85.8%）。

當(dāng)國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）較低時，血栓栓塞復(fù)發(fā)風(fēng)險上升，但當(dāng)INR超過4 mg·d-1時出血的風(fēng)險明顯增加，INR值直接決定患者華法令的使用劑量的大小。不同種族間華法令劑量有明顯差異，黃種人平均穩(wěn)定劑量約為3．0 mg·d-1，白人約為4．5 mg·d-1，黑人約為5．7 mg·d-1[6-7]，亞洲華人華法令劑量低于高加索人，漢族人與高加索人在CYP2C9基因多態(tài)性分布頻率上沒有顯著差異。本研究收集的病例為本院醫(yī)生根據(jù)患者病情的需要自主決定華法令劑量，并根據(jù)INR值調(diào)整后給予穩(wěn)定劑量。對患者華法令的用藥情況按不同基因型進(jìn)行分類統(tǒng)計，從結(jié)果可以看到以CYP2C9基因型進(jìn)行分類，野生型與突變型用藥劑量無明顯差異，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報道相似，從中可看出CYP2C9基因多態(tài)性并不能解釋不同種族間華法令劑量的個體差異，也有可能是CYP2C9基因突變位點較多，各個突變位點對華法令劑量的影響不同，對此有待進(jìn)一步研究。以VKORC1基因型進(jìn)行分類，在本研究中可以看出，未突變的AA型與突變的AG型用藥劑量有明顯差異，在INR值低于AA基因組的情況下AG型患者的用藥劑量明顯較高，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，含VKORC1突變型基因的人群達(dá)到臨床所需的抗凝療效所用的華法令劑量明顯高于非突變型人群，提示含VKORC1突變型基因的患者在使用華法令抗凝時應(yīng)適當(dāng)增加劑量。中國人群中含VKORC1突變型基因（17%）的比率低于白人（85%），這可能是導(dǎo)致中國人群華法令平均穩(wěn)定劑量低于白種人的主要原因。

華法令治療窗較窄，抗凝維持劑量受多種因素的影響，其中基因多態(tài)性是導(dǎo)致個體差異最主要的原因，基因?qū)虻慕o藥方式與傳統(tǒng)固定劑量的治療方案相比，可有效縮短達(dá)到穩(wěn)定劑量的時間，減少因劑量原因引起的出血或栓塞風(fēng)險，為臨床更安全有效用藥提供了依據(jù)。

[1] Yuan HY,Chen JJ,Lee MT,et al．A novel Functional VKORC1 promoter polymorphism is associated with inter-individualandinterethnicdifferencesinwarfarin sensitivity[J]．Hum Mol Genet,2005,14(13):1745-51．

[2] TakeuchiF,MeginnisR,BourgeoisS,etal．A genome-wideassociationstudyconfirmsVKORC1, CYP2C9,and CYP4F2 as principal genetic determinants of warfarin dose[J]．PLoS Genet,2009,5(3): el000433．

[3] Wadelius M,Chen L Y,Lindh JD,et al．The largest prospectiveWarfarin-treatedcohortsupportsgenetic forecasting[J]．Blood,2009,113(4):784-92．

[4] Zhu Y,Shennan M,Reynolds KK,et al．Estimation of Warfarin maintenance dose based on VKORC1(-1639 G＞A)and CYP2C9 genotypes[J]．Clin Chem,2007,53 (7):1199-205．

[5] Zeng WT,Zheng QS,Huang M,et al．Genetic polymorphisms of VKORC1,CYP2C9,CYP4F2 in Bai,Tibetan Chinese[J]．Pharmazie,2012,67(1):67-73．

[6] Wei M,Ye F,Xie D,et al．A new algorithm to predict warfarin dose from polymorphisms of CYP4F2,CYP2C9 and VKORC1 and clinical variables:Derivation in Han Chinese patients with mechanical heart valve replacement[J]．Thromb Haemost,2012,107(6):1083-91．

[7] Limdi NA,Wadelius M,Cavallari L,et al．Warfarin pharmaco-genetics:a single VKOEC1 polymorphism is predictive of dose across 3 racial groups[J]．Blood, 2010,115(18):3827-34．

Effects of CYP2C9 and VKORC1 Genetic Polymorphisms on Warfarin Maintenance Dosage of Anticoagulation*

NI li,CHU Ya-nan,ZHANG Jie-yu,ZHOU Guo-hua
Department of Pharmacology,General Hospital of Nanjing Military Area,Nanjing 210002,China

Objective：To investigate the polymorphism distribution and characteristics of cytochromeP450 2C9(CYP2C9)and vitamin K epoxide reductase complex(VKORC1)in Han population,as well as the relationship between each polymorphism and warfarin anticoagulation dose．Methods：Seventy-four patients in Han population with stable anticoagulation taking warfarin were recruited．TheirCYP2C9andVKORC1genotypes were tested by pyrosequencing,and their international normalized ratios(INR)were obtained．Results：Most of the patients in our study had wild typeCYP2C9,with similar warfarin doseage to those of mutated type．ForVKORC1genotype,most patients with wild type AA had lower warfarin doseage than those with the mutated variant．Conclusion：The genetic polymorphisms ofCYP2C9andVKORC1present in Han population,and theVKORC1genotypes could affect individualized warfarin dose in anticoagulation．

CYP2C9;VKORC1;Polymorphism;Warfarin;INR

R969.3

A

1673-7806（2014）06-492-03

江蘇省藥學(xué)會-奧賽康臨床藥學(xué)基金項目（201212）

倪立，女，副主任藥師 E-mail:jqzynl@163.com

2014-07-27

2014-08-15