武海萍，卜瑩，張心悅，周國(guó)華

1南京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，南京 210002；2南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院藥理科，南京 210002

維生素B12注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立*

武海萍1，卜瑩1，張心悅1，周國(guó)華2**

1南京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，南京 210002；2南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院藥理科，南京 210002

目的：建立維生素B12注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。方法：按《中國(guó)藥典》2010年版二部（附錄ⅪE）的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法及指導(dǎo)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：維生素B12注射液的最大不干擾濃度為0.25 mg·mL-1。在內(nèi)毒素限值確定為400 EU·mg-1情況下，用靈敏度為0.25 EU·mL-1的鱟試劑按凝膠限度檢查法對(duì)6批次供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。結(jié)論：建議藥典增加維生素B12注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)，規(guī)定每1mg維生素B12中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于400EU。

維生素B12注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素；凝膠限度檢查法

維生素B12注射液臨床上主要用于治療原發(fā)性或繼發(fā)性內(nèi)因子缺乏所致的巨幼細(xì)胞貧血，還可用于神經(jīng)炎的輔助治療等?！吨袊?guó)藥典》2010年版二部中維生素B12注射液未收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)[1]，而《美國(guó)藥典》（USP35-NF30）中已收載[2]。為了進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)注射液的質(zhì)量控制，依據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版二部中有關(guān)細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]，進(jìn)行維生素B12注射液干擾試驗(yàn)，建立了維生素B12注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。

1 材料

1.1 儀器

HG202-2型電熱干燥箱；ET-96型細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠檢測(cè)儀；WH-3型旋渦混合器；Eppendorf微量移液器；無熱原吸頭。

1.2 試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（效價(jià)160 EU/支，批號(hào)150601-201174，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；鱟試劑（靈敏度0．25 EU·mL-1，批號(hào)1206152，湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑（靈敏度0．25 EU·mL-1，批號(hào)1206190，湛江博康海洋生物有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號(hào)1110170，湛江安度斯生物有限公司）。

1.3 試藥

維生素B12注射液（規(guī)格1 mL∶0．5 mg，批號(hào)1108182、1103251、1108192，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司）；維生素B12注射液（規(guī)格1 mL∶0．5 mg，批號(hào)20101210、21109021、21110071，湖北天藥藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素限值的確定

根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版二部（附錄ⅪE）的有關(guān)要求[1]，內(nèi)毒素限值（L）按以下公式計(jì)算：L=K/ M。式中K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5 EU/（kg·h）；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量?！杜R床用藥須知》2010年版中規(guī)定維生素B12注射液的每日最大用量為500 μg[7]。因此代入公式計(jì)算，得到L值為600 EU·mg-1。而《美國(guó)藥典》中規(guī)定每1 μg維生素B12中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0．4 EU，其限值較公式計(jì)算出的數(shù)值更加嚴(yán)格。為保障安全用藥，故將維生素B12注射液的內(nèi)毒素限值確定為400 EU·mg-1。

2.2 鱟試劑靈敏度的復(fù)核

為了考察鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ）是否準(zhǔn)確、人員操作方法是否正確及實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定，按《中國(guó)藥典》2010年版二部（附錄ⅪE）中細(xì)菌內(nèi)毒素規(guī)定λc應(yīng)在0．5 λ～2 λ（包括0．5 λ和2 λ）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，批號(hào)1206152的鱟試劑λc值等于0．5 λ，批號(hào)1206190的鱟試劑λc值等于λ，均符合藥典規(guī)定，可以其標(biāo)示靈敏度0．25 EU·mL-1用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.3 干擾試驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)

為確定維生素B12注射液在多大濃度下對(duì)內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，首先進(jìn)行干擾試驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)。按照公式最大稀釋倍數(shù)Dλ0.03=CL/ λ0.03，計(jì)算得到維生素B12注射液Dλ0.03=6666.7，即最大的稀釋倍數(shù)不得超過6666.7倍。因此將維生素B12注射液供試品用BET水分別稀釋2、20、200、800、1600、3200、6400倍，將此系列溶液記為供試品陰性對(duì)照（NPC）；制備同樣系列濃度的供試液，并使每個(gè)稀釋倍數(shù)的供試液中均含有2 λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，記此系列溶液為供試品陽(yáng)性對(duì)照（PPC）。取靈敏度為0.25 EU·mL-1的鱟試劑，分別對(duì)上述NPC和PPC溶液進(jìn)行檢驗(yàn)，每一個(gè)平行做2支；另取2支鱟試劑加入2 λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽(yáng)性對(duì)照（PC）；2支加入BET水作為陰性對(duì)照（NC）。37℃保溫60 min后，觀察記錄結(jié)果。

使用兩個(gè)廠家鱟試劑的檢驗(yàn)結(jié)果見表1。陰性對(duì)照均為陰性，陽(yáng)性對(duì)照均為陽(yáng)性，表明實(shí)驗(yàn)有效；兩個(gè)廠家的鱟試劑檢驗(yàn)結(jié)果相同，2個(gè)供試品對(duì)鱟試劑的反應(yīng)結(jié)果也相同，表明該品種適于建立內(nèi)毒素檢查法；在系列濃度中出現(xiàn)供試品陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性且供試品稀釋液為陰性的最小稀釋倍數(shù)為2，即維生素B12注射液的最大不干擾濃度為0.25 mg· mL-1。

表1 維生素B12注射液干擾試驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 正式干擾試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)時(shí)選擇供試品的不干擾濃度為0.0625 mg·mL-1。取兩個(gè)不同廠家的共6個(gè)供試品，用BET水稀釋8倍至終濃度為0.0625 mg·mL-1，分別用0.0625 mg·mL-1的供試品稀釋液和BET水稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，制備成含0.5、0.25、0.125、0.0625EU·mL-14種濃度內(nèi)毒素的系列溶液。按照《中國(guó)藥典》2010年版中的凝膠法進(jìn)行干擾試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 維生素B12注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果

使用湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的鱟試劑（批號(hào)1206152）的檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Es等于0.5 λ（0.125 EU·mL-1），且6批供試品的Et值均等于Es。使用湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)的鱟試劑（批號(hào)1206190）的檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Es等于λ（0.25 EU· mL-1），且6批供試品的Et值均在0.5～2 Es（0.125～0.5 EU·mL-1）?！吨袊?guó)藥典》2010年版中規(guī)定Es在0.5～2 λ（包括0.5 λ和2 λ）及Et在0.5～2 Es（包括0.5 Es和2 Es）時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。因此，本干擾試驗(yàn)的結(jié)果表明，用兩個(gè)廠家的鱟試劑（靈敏度均為0.25 EU·mL-1）進(jìn)行檢驗(yàn)，該6批供試品在8倍稀釋條件下均無干擾作用。

2.5 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

用靈敏度為0.25 EU·mL-1的鱟試劑，按《中國(guó)藥典》2010年版二部（附錄ⅪE）中的凝膠限度試驗(yàn)檢查法，對(duì)6批次供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。計(jì)算最大有效稀釋倍數(shù)MVD=800。將供試品稀釋800倍制備成供試品溶液（NPC），制備供試品溶液中含2 λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（PPC），同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照即2 λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照即BET水。檢驗(yàn)結(jié)果顯示6批次供試品的檢驗(yàn)結(jié)果均符合內(nèi)毒素限值為400 EU·mg-1的規(guī)定。

3 討論

供試品對(duì)不同廠家的鱟試劑的干擾程度可能存在不同，因此在干擾試驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)中使用了兩個(gè)不同廠家的鱟試劑，分別對(duì)兩個(gè)生產(chǎn)廠家各2個(gè)批次的維生素B12注射液進(jìn)行凝膠法內(nèi)毒素檢查，結(jié)果顯示兩個(gè)廠家的鱟試劑檢驗(yàn)結(jié)果相同，不同生產(chǎn)廠家以及同一廠家不同批次的供試品對(duì)鱟試劑的反應(yīng)結(jié)果也無差異，因此確定維生素B12注射液的最大不干擾濃度為0.25 mg·mL-1。在正式干擾實(shí)驗(yàn)中，將供試品稀釋至0.0625 mg·mL-1，用兩個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行干擾驗(yàn)證，結(jié)果顯示Es均在0.5～2 λ范圍，6個(gè)供試品的Et均在0.5～2Es范圍，確認(rèn)在該濃度下供試品無干擾作用。

在內(nèi)毒素限值確定為400 EU·mg-1情況下，用靈敏度為0.25 EU·mL-1的鱟試劑按凝膠限度檢查法對(duì)6批次供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均符合規(guī)定，表明維生素B12注射液可適用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。因此，建議《中國(guó)藥典》增加維生素B12注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)，規(guī)定每1 mg維生素B12中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于400 EU。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：901，附錄99-101.

[2] The United States Pharmacopeial Convention.United States Pharmacopoeia(USP35-NF30)[S].United Book Press,Inc.,Baltimore,MD,2012:2784.

[3] 中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：310-25.

[4] 樊華，林鵬，焉媛媛，等.9個(gè)生產(chǎn)企業(yè)清開靈注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16（4）：48-50.

[5] 時(shí)榮同，謝冬梅，郭道華，等.地佐辛注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2013，8（31）：3-4.

[6] 代秀梅，于風(fēng)平.氟馬西尼注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立[J].中國(guó)藥房，2014，25（21）：2003-4.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典臨床用藥須知：化學(xué)藥和生物制品卷[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1052-4.

Development of Bacterial Endotoxin Test Method for Vitamin B12Injection

WU Hai-ping1,BU Ying1,ZHANG Xin-yue1,ZHOU Guo-hua2*
1The Institute of Quality Control of Medical Material and Equipment under the Joint Logistic Department of Nanjing Command,Nanjing 210002;2Department of Pharmacology,Jinling Hospital,Medical School of Nanjing University,Nanjing,210002,China

Objective：To establish a detection method of the bacterial endotoxin in Vitamin B12injection.Methods：The experiments were done according to the bacterial endotoxin detection method and guiding principles in Chinese Pharmacopoeia 2010 edition(appendixⅪE).Results：The maximum undisturbed concentration of vitamin B12injection was 0.25 mg·mL-1in the bacterial endotoxin test.Six batches of samples were detected by using limulus reagents wit sensitivity at 0.25 EU·mL-1,and the results were all qualified to the standards under the threshold of bacterial endotoxin within 400 EU·mg-1.Conclusion：The bacterial endotoxin inspection items should be supplied in Chinese Pharmacopoeia,and the amount of bacterial endotoxin in Vitamin B12should be under 400 EU per mg.

Vitamin B12injection;Bacterial endotoxin;Gel limit test

R927.12

A

1673-7806（2014）06-521-03

第54批中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（2013M542575）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31300706）

武海萍，女，博士，主管藥師，研究方向：藥物分析 E-mail:fenger19800512@126.com

**通訊作者 周國(guó)華，男，主任藥師 E-mail:ghzhou@nju.edu.cn

2014-06-29

2014-07-18