聶靜，王顏剛

（青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 青島 266071）

間充質(zhì)干細胞（MSCs）是多潛能、自我更新細胞，能分泌多種營養(yǎng)因子和免疫調(diào)節(jié)因子，參與各種組織器官的修復［1－3］，近年來 MSCs在糖尿病治療方面作用引起了全球廣泛關(guān)注。而人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUCMSCs）具有來源豐富、采集簡便、增殖能力強、免疫原性低等優(yōu)點，成為MSCs臨床應用最有前途的細胞來源之一［4］。本研究選擇雄性 Wistar大鼠制備鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠模型，靜脈應用hUCMSCs及聯(lián)合西格列汀進行干預，觀察其對大鼠肝臟蛋白激酶B（AKT）表達的影響。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

取8周齡健康雄性SPF級Wistar大鼠32只，體質(zhì)量（200±20）g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。hUCMSCs來源于我院中美干細胞中心，其需氧菌、厭氧菌、真菌、支原體等微生物檢測結(jié)果均為陰性，細胞表面抗原檢測符合MSCs的表型特征：CD34－，CD45－，HLA－DR－，CD90＋，CD105＋，用PBS稀釋至細胞密度為0.5×109／L。主要試劑如下：DMEM 低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、5g／L胰酶、STZ，美國Sigma公司；青霉素及鏈霉素、PBS，西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；高糖高脂飼料，北京華阜康生物科技股份有限公司；兔抗鼠AKT單克隆抗體，美國Proteintech公司；DAB顯色試劑盒，武漢博士德公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為糖尿病組（24只）及正常對照組（8只）。糖尿病組先給予高糖高脂飲食6周，然后給予小劑量STZ（30mg／kg）腹腔注射，10d后連續(xù)兩次檢測空腹血糖≥11.1mmol／L即認為造模成功，成模后給予普通飼料喂養(yǎng)。正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組及處理方法 將成功建模后的糖尿病大鼠隨機分為糖尿病對照組、hUCMSCs組以及hUCMSCs聯(lián)合西格列汀治療組（聯(lián)合組），每組8只。hUCMSCs組：分別在成模后第1、5周給予大鼠尾靜脈注射hUCMSCs，每只2mL（1.0×106個細胞）；聯(lián)合組：造模成功后開始給予大鼠西格列汀10mg／（kg·d）灌胃治療10周，分別在造模成功后第1、5周給予大鼠尾靜脈注射hUCMSCs治療，每只2mL（1.0×106個細胞）；正常對照組與糖尿病對照組不予治療。

1.2.3 肝臟組織AKT表達檢測 采用免疫組織化學染色方法進行檢測。成模后第10周處死各組大鼠，取出肝臟組織，置于40g／L甲醛溶液中固定24h，脫水、石蠟包埋、切片，行免疫組化染色檢測，光學顯微鏡下（200倍）觀察各組AKT胞漿著色情況，每張圖片觀察4個視野。AKT定位于細胞質(zhì)，無背景著色情況下均以細胞漿出現(xiàn)黃色顆粒者為陽性。免疫組化染色結(jié)果采用半定量評分方法判定：①計算陽性細胞百分數(shù)并賦予分值，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；②觀察著色強度并賦予分值，無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。以陽性細胞百分數(shù)分值與著色強度分值乘積判定結(jié)果：0分為（－），1～4分為（＋），5～8分為（），9～12分為（）。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)間比較采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

聯(lián)合組及hUCMSCs組肝臟組織AKT表達均明顯高于糖尿病對照組，但低于正常對照組，差異有顯著性（Hc＝25.085，q＝3.211～9.275，P＜0.05），聯(lián)合組高于hUCMSCs組（q＝5.967，P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 各組大鼠肝臟組織AKT表達比較（n＝8，只）

3 討 論

AKT信號通路是胰島素主要的下游分子通路。AKT通過對葡萄糖轉(zhuǎn)運、糖原合成、糖酵解和糖異生的調(diào)節(jié)及其基因突變、沉默、敲除和AKT酶活性改變，影響著葡萄糖的代謝及糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。AKT磷酸化通過胰島素依賴的方式進行，可在三個水平上調(diào)控葡萄糖代謝。①AKT通過誘導葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1和GLUT3的表達及GLUT4向質(zhì)膜的移位促進葡萄糖攝?。淮送?，AKT通過增加內(nèi)吞影響葡萄糖轉(zhuǎn)運，從而維持血糖穩(wěn)定［5］。②通過糖原合成酶激酶3（GSK3）促進糖原合成。③通過磷酸果糖激酶2（6－PF2－K）誘導糖酵解。AKT調(diào)控嚴密精確，其調(diào)控紊亂可引起多種疾病，如糖尿病等。已有研究顯示，AKT敲除的小鼠會出現(xiàn)糖尿病，并且胰島素靶組織對葡萄糖利用減少［6］。BAE等［7］研究顯示，在AKT基因敲除的脂肪細胞中，通過過表達AKT的方式，可以恢復正常胰島素介導的葡萄糖攝取。

近年來，MSCs在糖尿病治療方面作用引起了廣泛關(guān)注。多項研究已經(jīng)證明，MSCs在體外胰島細胞培養(yǎng)條件誘導下，具有向胰島素分泌細胞分化的潛能，表達與功能性胰島β細胞生成相關(guān)的多個基因，并能以葡萄糖依賴方式釋放胰島素，移植到體內(nèi)能使STZ誘導的裸鼠糖尿病癥狀減輕［8－10］。在各種來源的MSCs中，hUCMSCs因具有來源豐富、易于獲得、采集簡便、免疫原性低等優(yōu)勢，具有更廣泛的應用與研究價值［11－13］。而西格列汀（DPP－4抑制劑）能夠通過減少GLP－1在體內(nèi)的降解而降低血糖水平，已廣泛應用于2型糖尿病的治療［14］。肝臟是胰島素作用的重要靶組織，本實驗結(jié)果顯示，hUCMSCs組及hUCMSCs聯(lián)合西格列汀組大鼠肝臟組織中AKT的表達均明顯高于糖尿病對照組，表明hUCMSCs移植能改善糖尿病引起的AKT表達降低。西格列汀可能通過減少GLP－1在體內(nèi)的降解而降低血糖，從而加強hUCMSCs改善糖尿病大鼠由于血糖過高引起的AKT表達降低作用。

圖1 各組大鼠肝臟AKT免疫組化染色結(jié)果

綜上所述，hUCMSCs聯(lián)合西格列汀治療能改善因糖尿病引起的AKT表達降低，可能為2型糖尿病治療提供新思路。

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