谷 偉，戰(zhàn)崳華，鄧志平，陸 偉

細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出一些復(fù)雜的機制來適應(yīng)環(huán)境的改變，碳代謝抑制就是其中之一。最早發(fā)現(xiàn)的碳代謝抑制現(xiàn)象是大腸桿菌中糖的分級吸收。碳代謝抑制是細(xì)菌重要的全局調(diào)控現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)菌處于多種碳源同時存在的條件時，碳代謝抑制允許其優(yōu)先利用優(yōu)勢碳源，同時抑制劣勢碳源的利用。碳代謝抑制也決定著細(xì)菌生長速度和碳源的選擇性吸收，能夠優(yōu)化細(xì)菌自身代謝，提高其在自然環(huán)境中的競爭力。碳代謝抑制是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，在不同菌種中的分子機制各異。大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）中的碳代謝抑制機制是誘發(fā)排斥和cAMP依賴的轉(zhuǎn)錄，但這些機制在假單胞菌（Pseudomonas）中并非主要作用。

研究表明，假單胞菌中涉及三種碳代謝抑制的調(diào)控系統(tǒng)，分別是CbrAB／Crc系統(tǒng)、CyoABCDE系統(tǒng)及PTSNtr系統(tǒng)。這些系統(tǒng)同時存在，各自獨立同時系統(tǒng)間存在聯(lián)系。這些系統(tǒng)已經(jīng)在惡臭假單胞菌（P.putica）和銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）中得到深入研究。本文將對假單胞菌中的三種涉及碳代謝抑制的調(diào)控系統(tǒng)的機制進(jìn)行闡述。

1 Cbr AB／Crc系統(tǒng)

1.1 Cbr AB／Crc 系統(tǒng)的組成

CbrAB／Crc系統(tǒng)由維持細(xì)菌碳氮平衡的雙組份CbrA／CbrB、非編碼的sRNA以及全局調(diào)控子Crc組成。CbrA為感應(yīng)蛋白，具有磷酸激酶功能，可感知環(huán)境因子的信號，并相應(yīng)地催化自身以及CbrB的磷酸化。CbrB為效應(yīng)蛋白，它正調(diào)控sRNA，如 CrcZ和 CrcY sRNA。 Crc是 CbrAB／Crc系統(tǒng)中的重要組成元件，是一種全局調(diào)控子，其表達(dá)水平依據(jù)于生長條件不同而變化，在后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)［1，2］。 效應(yīng)蛋白調(diào)控的 sRNA與細(xì)胞中自由的Crc結(jié)合，從而調(diào)節(jié)Crc在細(xì)胞內(nèi)的水平，而Crc的水平直接影響到劣勢碳源代謝基因的表達(dá)。

1.2 Cbr AB／Crc 系統(tǒng)的調(diào)控機制

Crc最早發(fā)現(xiàn)于銅綠假單胞菌中，其調(diào)控機制已經(jīng)在惡臭假單胞菌OCT質(zhì)粒的烷烴代謝途徑中被揭示，即AlkS轉(zhuǎn)錄激活子誘導(dǎo)烷烴代謝基因的表達(dá)。當(dāng)烷烴存在時，Crc結(jié)合編碼AlkS蛋白的mRNA 5′末端，使其轉(zhuǎn)錄受到抑制，導(dǎo)致其不能完成翻譯，這就使得碳代謝抑制發(fā)生［3］。這種機制同樣存在于銅綠假單胞菌［4］和惡臭假單胞菌中［5］，銅綠假單胞菌中amiE mRNA和惡臭假單胞菌中的 benR mRNA的轉(zhuǎn)錄都受到 Crc的抑制。

當(dāng)Crc在細(xì)胞內(nèi)維持高水平時，Crc能夠結(jié)合目的基因轉(zhuǎn)錄起始位點前的Crc結(jié)合位點，從而阻止其轉(zhuǎn)錄表達(dá)來抑制碳源利用的作用，但當(dāng)sRNA在細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)時，它們會結(jié)合自由的Crc，使得Crc的水平降低，劣勢碳源代謝基因的轉(zhuǎn)錄抑制被解除。目前發(fā)現(xiàn)的一些受Crc抑制的劣勢碳源代謝基因包括銅綠假單胞菌中涉及支鏈氨基酸吸收的基因bkd［6］，惡臭假單胞菌中涉及吸收苯甲酸、4?羥基苯甲酸和4?羥苯基丙酮酸的基因［7］，惡臭假單胞菌GPol中涉及烷烴降解的基因，惡臭假單胞菌pWW0質(zhì)粒中涉及甲苯降解的基因［8］以及假單胞菌 EST1001中涉及石碳酸降解的基因［9］。

CrcZ sRNA的發(fā)現(xiàn)將CbrA／CbrB雙組份的活性與Crc的功能串聯(lián)起來。它首先在銅綠假單胞菌中被發(fā)現(xiàn)［10］，全長 407個 nt，具有 6個特異的Crc識別位點，其表達(dá)受CbrA／CbrB雙組份的調(diào)控。當(dāng)銅綠假單胞菌在非優(yōu)勢碳源（如甘露醇或乙酰胺）中生長時，CbrA／CbrB雙組份正調(diào)控crcZ基因并使其高效轉(zhuǎn)錄，高水平的CrcZ與自由的Crc結(jié)合，從而降低了其在細(xì)胞內(nèi)的水平，Crc對非優(yōu)勢碳源代謝基因表達(dá)的抑制被解除，如圖1所示［4］。 相反，當(dāng)琥珀酸作為碳源時，CbrA／CbrB雙組份的活性受到抑制，CrcZ在細(xì)胞內(nèi)的水平較低，從而導(dǎo)致Crc蛋白抑制目標(biāo)mRNA，非優(yōu)勢碳源不能被利用［4］。

圖1 降解物阻遏調(diào)控模型［4］Fig.1 Model of catabolite repression control［4］.

1.3 Cbr AB／Crc 系統(tǒng)的其他相關(guān)蛋白

在惡臭假單胞菌中，除CrcZ sRNA外，還存在著另一個類似的sRNA，命名為CrcY［10］。它們具有相似的序列、二級結(jié)構(gòu)及功能。在碳代謝抑制條件下，CrcZ與CrcY的水平低于非抑制條件下的水平。單獨突變crcZ或crcY不會影響碳代謝抑制作用，因為當(dāng)缺失crcZ或crcY后，剩下的另一個sRNA的表達(dá)量會大幅提高，來彌補缺失的sRNA，CrcZ與CrcY的功能互補使得缺失其中一個sRNA并不影響碳代謝抑制的發(fā)生［10］。但同時缺失crcZ與crcY后，碳代謝抑制作用明顯。在LB培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)菌處在對數(shù)期時，過表達(dá)CrcZ或CrcY會明顯減弱Crc依賴的碳代謝抑制，表明碳代謝抑制作用與sRNA關(guān)系緊密。當(dāng)優(yōu)勢碳源存在時，CrcZ與CrcY的水平較低，而自由的Crc水平較高，它們能夠結(jié)合目標(biāo)RNA，抑制其翻譯；相反，當(dāng)無優(yōu)勢碳源存在時，CrcZ與CrcY的水平明顯升高，從而抑制了Crc蛋白，無Crc蛋白結(jié)合抑制則目標(biāo)mRNA可與核糖體結(jié)合進(jìn)行正常翻譯。

1.4 Cbr AB／Crc 系統(tǒng)涉及的其他功能

除了對碳代謝途徑的控制，CbrAB／Crc信號傳導(dǎo)途徑還有許多功能。研究發(fā)現(xiàn)，在惡臭假單胞菌中，Crc調(diào)控一些氨基酸轉(zhuǎn)運基因的表達(dá)，使得纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸等氨基酸吸收基因的表達(dá)受到抑制［11］。在完全培養(yǎng)基中生長時，Crc抑制OprB1孔道蛋白表達(dá)，阻礙葡萄糖的吸收，同時葡萄糖和果糖的內(nèi)膜運輸?shù)鞍缀臀者@些糖所需的基因也被抑制。Crc的缺失導(dǎo)致葡萄糖酸和6?磷酸葡萄糖酸的吸收基因表達(dá)水平提高，這間接表明葡萄糖的吸收受Crc的抑制［11］。在銅綠假單胞菌中，蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示Crc抑制一些孔蛋白的合成，這解釋了crc突變株對特定抗生素敏感性增強的原因［12］。同時Crc也抑制藍(lán)色素和毒力因子綠膿菌素的產(chǎn)生，且Crc的缺失誘導(dǎo)編碼胞外多糖的基因簇過表達(dá)，影響了蹭行運動、III型分泌器和生物質(zhì)膜的形成［13］。在銅綠假單胞菌中，cbrB的突變導(dǎo)致生物質(zhì)膜減少［14］。在惡臭假單胞菌中，CBrAB雙組份系統(tǒng)不僅控制生長底物的吸收，而且還控制抗逆性和生物質(zhì)膜的形成［15］。

2 CyoABCDE系統(tǒng)

2.1 CyoABCDE 系統(tǒng)的組成

CyoABCDE系統(tǒng)是由一些編碼電子鏈末端氧化酶的基因簇組成，在惡臭假單胞菌中，存在一個至少含有5個末端轉(zhuǎn)移酶的分支電子傳遞鏈，如圖2所示［16］，這個分支同樣存在于銅綠假單胞菌中。（應(yīng)把電子鏈上的主要氧化酶分別介紹一下，編碼基因，酶的特性，信號傳遞的順序等，至少要單獨介紹一下cyo）這些氧化酶在氧充足條件下對細(xì)胞生長起著重要作用，而且每一個末端氧化酶通常對氧具有不同的親和力，故具有不同的氧化還原能力，且作為質(zhì)子泵具有不同的效率。

圖2 惡臭假單胞菌中的好氧呼吸鏈［16］Fig.2 Aerobic respiratory chain of Pseudomonas putida［16］.

2.2 CyoABCDE系統(tǒng)的調(diào)控機制

CyoABCDE系統(tǒng)通過假單胞菌好氧呼吸鏈中電子的轉(zhuǎn)移來調(diào)控基因的表達(dá)［17］。由乳酸、琥珀酸等電子供體通過好氧呼吸鏈將電子傳遞給細(xì)胞膜上的泛醌，由泛醌傳遞給Cyo末端氧化酶，再由Cyo通過一系列的信號傳導(dǎo)來調(diào)控非優(yōu)勢碳源代謝基因的表達(dá)，從而影響細(xì)菌對碳源的利用，但Cyo調(diào)控基因表達(dá)的信號尚不清楚。目前只知道在一些細(xì)菌中，雙組份系統(tǒng)能夠感應(yīng)來自電子傳遞鏈的信號，例如處在氧化還原狀態(tài)的醌或者是末端轉(zhuǎn)移酶中的電子流［18，19］。通過磷酸化轉(zhuǎn)錄調(diào)控子來產(chǎn)生感應(yīng)效應(yīng)，它能夠直接激活或抑制基因的表達(dá)。假單胞菌中很可能含有接受Cyo末端氧化酶信息的雙組份，通過這一過程實現(xiàn)信號傳遞進(jìn)而完成基因的調(diào)控，但是目前這種假設(shè)還沒有實驗來證明。

Cyo氧化酶基因的表達(dá)依據(jù)生長條件改變而變化。當(dāng)細(xì)胞處于完全培養(yǎng)基對數(shù)期且氧充足條件時，它的表達(dá)量高；當(dāng)氧被限制或細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期時，它的表達(dá)量降低［20，21］。 不僅如此，Cyo 氧化酶基因的表達(dá)也依賴于碳源。當(dāng)細(xì)菌在能夠誘導(dǎo)碳代謝抑制的碳源存在的培養(yǎng)基生長時（如琥珀酸或氨基酸），它的表達(dá)量高于細(xì)胞在檸檬酸中水平，檸檬酸在惡臭假單胞菌中不能抑制烷烴代謝途徑［21］。Cyo不僅是電子傳遞鏈的末端氧化酶，而且還是全局調(diào)控系統(tǒng)的組成部分，它通過感應(yīng)和轉(zhuǎn)換電子傳遞鏈的活性的信號影響碳氮代謝，所以Cyo的水平可能與碳代謝抑制強度相關(guān)。

轉(zhuǎn)錄組分析表明，Cyo氧化酶的失活不僅影響烷烴或石碳酸降解基因的誘導(dǎo)表達(dá)，而且在豐富培養(yǎng)基中調(diào)控100多個基因的表達(dá)［20］，這也表明Cyo參與了全局調(diào)控過程。大部分被Cyo影響的是編碼質(zhì)子泵的基因，包括有機酸、芳香化合物的運輸子，各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控子以及電子傳遞鏈的組成部分。Crc和Cyo的同源性很低，說明它們處于各自獨立的全局調(diào)控系統(tǒng)。在惡臭假單胞菌中，Cyo氧化酶的失活影響了一些氨基酸、苯甲酸、果糖和各種有機酸作為碳源的利用以及氨基酸和尿素作為氮源的利用，這進(jìn)一步表明在假單胞菌中碳氮代謝調(diào)控中，Cyo末端氧化酶具有重要作用。

3 PTSNtr系統(tǒng)

3.1 PTSNtr系統(tǒng)的組成與功能

在假單胞菌中，存在一類不涉及糖類攝取的PTS分支系統(tǒng)，叫做PTSNtr系統(tǒng)。它由PtsP、PtsO及PtsN蛋白組成，這些蛋白分別同源于EINtr、NPr和 EIINtr蛋白［22］。

目前PTSNtr系統(tǒng)中各蛋白的研究還還處于起步階段。研究發(fā)現(xiàn)在一些革蘭氏陰性菌中，并非pstP基因位于rpoN操縱子內(nèi)部，而是pstN，且與rpoN 共轉(zhuǎn)錄［22，23］。 rpoN 基因編碼選擇性 δ 因子，它涉及碳源與氮源的代謝、鞭毛的合成和其它功能基因的表達(dá)［24］。PstN在PTSNtr系統(tǒng)中極為重要，PstN的磷酸化導(dǎo)致碳代謝抑制的產(chǎn)生。PtsN基因在不同菌中的缺失突變揭示了其在調(diào)控中的部分功能。例如在肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）中，缺失突變pstN的會導(dǎo)致nifH的轉(zhuǎn)錄增強，nifH是一種涉及氮代謝的基因［25］。在銅綠假單胞菌中，缺失突變pstN后一些δ54依賴的基因不能被誘導(dǎo)［26］。大腸桿菌中，缺失突變pstN會影響其在含有劣勢氮源的培養(yǎng)基中生長，但對含豐富氮源（谷氨酰胺或銨）的培養(yǎng)基影響不大［23］。缺失突變ptsN還會導(dǎo)致大腸桿菌對亮氨酸的生長抑制非常敏感［27］。這些缺失突變pstN后的現(xiàn)象都表明PTSNtr系統(tǒng)提供了一個細(xì)菌碳氮吸收調(diào)控連接。

3.2 PTSNtr系統(tǒng)的調(diào)控機制

PTSNtr系統(tǒng)通過系統(tǒng)內(nèi)的磷酸基團轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)對碳源的調(diào)控，磷酸基團從PEP轉(zhuǎn)移到PtsP上，然后再磷酸化PtsO，最終將磷酸基團轉(zhuǎn)移到PtsN［22，28］。 與涉及糖類攝取的 PTS 系統(tǒng)不同的是，未磷酸化的PtsN也參與了一些代謝基因的調(diào)控，但具體調(diào)控機制尚不清楚。PTSNtr系統(tǒng)也沒有相當(dāng)于EIIBCA糖類轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的膜組分，它的磷酸化過程也不像糖類PTS系統(tǒng)那樣依賴于磷酸基團的流動。目前無證據(jù)表明PtsN能夠向底物轉(zhuǎn)移磷酸基團，PtsP／PtsO／PtsN蛋白功能可能只傳導(dǎo)信號，而磷酸化的PtsN提供調(diào)控信號，見圖 3［16］。

圖 3 PTSNtr系統(tǒng)［16］Fig.3 The PTSNtr system［16］.

近期研究也發(fā)現(xiàn)了一些能與PTSNtr系統(tǒng)中PtsN蛋白相互作用的新靶標(biāo)，這些發(fā)現(xiàn)擴展了PTSNtr系統(tǒng)的調(diào)控范圍。比如，大腸桿菌中未磷酸化的PtsN能與親和力較低的鉀離子轉(zhuǎn)運子TrkA相互作用，抑制TrkA對鉀離子的吸收［27］。此外，未磷酸化的PtsN也能刺激編碼親和力較高的鉀離子轉(zhuǎn)運子KdpFABC的基因表達(dá)［29］。這些發(fā)現(xiàn)表明PTSNtr系統(tǒng)可能在維持鉀離子體內(nèi)平衡方面發(fā)揮重要作用。PTSNtr系統(tǒng)還會影響一些響應(yīng)碳代謝抑制信號的基因的表達(dá)。在惡臭假單胞菌pWW0質(zhì)粒中，δ54依賴的Pu啟動子涉及甲苯和二甲苯的吸收。當(dāng)甲苯或二甲苯存在時，效應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活子XylR能夠誘導(dǎo)Pu啟動子轉(zhuǎn)錄。但當(dāng)同時存在甲苯和某些生理信號（如葡萄糖或琥珀酸）時，XylR對Pu啟動子轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用會被減弱，誘導(dǎo)作用將下調(diào)到一定范圍內(nèi)［30，31］。 然而，PtsN的失活會使葡萄糖或琥珀酸對Pu啟動子的抑制減弱［32，33］，但不會影響葡萄糖的消耗。 這一現(xiàn)象表明減少糖類運輸而能夠間接影響由PtsN的失活產(chǎn)生的抑制減弱。

磷酸化對PTSNtr系統(tǒng)的調(diào)控作用十分重要。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)ptsO基因失活后，無論培養(yǎng)環(huán)境中是否存在葡萄糖，Pu啟動子的活性都被抑制。ptsO基因失活對Pu啟動子影響與ptsN基因失活后相反［34］。這些都證明了磷酸化在PTSNtr系統(tǒng)調(diào)控中的重要性。ptsN與ptsO雙突變株的表型與rpoN突變株的表型相同，即葡萄糖對Pu的抑制減弱［35］。PtsO可以作為磷酸基團的受體，因為定點突變PtsO蛋白保守的His殘基會使其失活。所以磷酸化的PtsO可能需要葡萄糖對Pu調(diào)控的抑制。PtsN的活性也可能受 PtsO調(diào)控，因為PtsO可以作為PtsN去磷酸化過程中磷酸基團的受體。當(dāng)葡萄糖存在時，PtsO接受磷酸基團，從而增加非磷酸化的PtsN的水平，這一過程可能是對Pu抑制的調(diào)控。而當(dāng)葡萄糖耗盡時，磷酸基團會被轉(zhuǎn)移回PtsN［34］。目前對引起PtsN的磷酸化或去磷酸化的生理信號還不完全了解。惡臭假單胞菌中存在一些葡萄糖代謝的誘導(dǎo)物，如2?酮基?3?脫氧?6?磷酸葡萄糖（KDPG），它對于葡萄糖調(diào)控的代謝抑制很重要，推測其可能直接或間接地影響了 PtsN 的磷酸化［35，36］。

4 討論

在假單胞菌中，碳代謝抑制是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，涉及到 CbrAB／Crc、CyoABCDE及 PTSNtr三種系統(tǒng)。它們同時存在，相互獨立，可能也存在著聯(lián)系。研究表明惡臭假單胞菌中可能存在接受Cyo末端氧化酶信息的雙組份，而CbrAB／Crc系統(tǒng)中就包含維持細(xì)菌碳氮平衡的雙組份CbrA／CbrB，它們之間可能存在聯(lián)系來協(xié)同產(chǎn)生碳代謝抑制，但這種假設(shè)尚無實驗來證明。而PTSNtr系統(tǒng)與糖轉(zhuǎn)運PTS系統(tǒng)之間存在交集，PTSNtr系統(tǒng)中非磷酸化的PtsN也參與基因的調(diào)控，這些可能把PTSNtr系統(tǒng)對代謝的調(diào)控與前兩個系統(tǒng)聯(lián)系起來。細(xì)胞內(nèi)可能存在三個系統(tǒng)同時發(fā)揮作用，協(xié)同調(diào)控碳代謝抑制。三個系統(tǒng)之間聯(lián)系對于碳代謝抑制的研究意義重大，對其進(jìn)行深入研究，會進(jìn)一步提高我們對碳代謝抑制調(diào)控機制的認(rèn)識。

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