楊煌建， 張祝蘭， 黃小珍， 鄭 衛(wèi)*

1.福建微生物研究所，福州350007;

2.江蘇康緣制藥有限公司，江蘇連云港222002

隨著達(dá)托霉素(daptomycin)［1，2］的研發(fā)成功，環(huán)脂肽類抗生素的研究成為近年來研究的熱點。安福霉素(amphomycin)［3］最早報道于20世紀(jì)50年代，但該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)直到2000年才最終確證，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與達(dá)托霉素相似，同屬環(huán)脂肽類化合物［4］。研究表明，安福霉素具有良好的抗革蘭氏陽性菌活性［5～7］。2011 年，Dominique 等［8］報道了安福霉素半合成衍生物MX-2401［9］的抗菌活性，MX2401對耐萬古霉素腸球菌(簡稱VRE)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)等具有很好的抗菌能力，對支氣管肺炎動物模型有更好的治療作用。與達(dá)托霉素相比，MX2401具有更長的抗生素后遺效應(yīng)和半衰期［9］，減少了給藥次數(shù)，從而減小了藥物毒性。MX2401及多個安福霉素衍生物已進(jìn)入了臨床前試驗，具有廣闊的研究開發(fā)前景。但目前國內(nèi)對安福霉素的研究報道甚少。為獲得安福霉素的高效發(fā)酵培養(yǎng)條件，本文對前期自然分離選育的安福霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化研究，以期為安福霉素的后續(xù)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

鏈霉菌菌株Streptomyces canus FIM-0916由本課題組保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(ISP-2):酵母提取物4 g/L，麥芽提取物10 g/L，葡萄糖4 g/L，瓊脂 18.0 g/L。

種子培養(yǎng)基:蔗糖 30 g/L，KNO31 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨 5 g/L，酵母膏 2 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L。

原始發(fā)酵培養(yǎng)基:黃豆粉10 g/L，葡萄糖10 g/L，NaCl 5 g/L，KNO31 g/L，CaCO31 g/L，pH 7.3 ～7.5。

1.3 主要試劑

安福霉素購自Sigma公司;甘油、蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、棉籽粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、KNO3、FeSO4、ZnSO4、MgSO4、CaCO3和甘氨酸等14種氨基酸均為國產(chǎn)分析純。

1.4 主要實驗設(shè)備

搖床(太倉市科教器材廠，回轉(zhuǎn)ZD8802C)，高效液相色譜分析儀(日本島津，20A-DAD)。

1.5 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

菌株斜面培養(yǎng)成熟后接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，種子培養(yǎng)液按1.0%的量加入發(fā)酵液中，三角瓶裝液量為100mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間120 h。

1.5.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 分別對發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和氮源進(jìn)行優(yōu)化，碳源備選有甘油、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖和麥芽糖，等量替代原始培養(yǎng)基中的葡萄糖作為碳源，比較安福霉素的發(fā)酵效價，確定最佳碳源。氮源備選有棉籽粉、酵母膏、牛肉膏和蛋白胨，等量替代原始培養(yǎng)基中的黃豆粉作為氮源，比較安福霉素的發(fā)酵效價，確定最佳氮源。

1.5.2 其他影響因素 分別考察培養(yǎng)基中添加不同氨基酸前體和無機(jī)鹽對發(fā)酵的影響。氨基酸前體有14種，分別為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、絡(luò)氨酸、組氨酸、色氨酸和脯氨酸。氨基酸前體的添加量為0.1%，以不添加氨基酸的原始發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。考察5種無機(jī)鹽，以原始發(fā)酵培養(yǎng)基中不加KNO3和CaCO3為對照，在對照配方上分別加入0.1%的 KNO3、FeSO4、Zn-SO4、MgSO4和 CaCO3，進(jìn)行單因子試驗。

1.5.3 正交試驗 以實驗確認(rèn)的碳源、氮源、氨基酸前體和無機(jī)鹽為四因素，設(shè)計四因素三水平L9(34)正交試驗(見表1)，確定最佳培養(yǎng)基配方。

表1 正交試驗設(shè)計因素水平表Table 1 The factors and levels for the orthogonal design.

1.5.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化 分別考察種齡(30 h、42 h、48 h、54 h、65 h、72 h 和 78 h)、接種量(0.5%、1%、1.5%、2%、5%和 10%)、裝液量(每500mL 搖瓶中裝液 60mL、80mL、100mL、120mL和150mL)、發(fā)酵周期(72 h、96 h、120 h、144 h 和168 h)和溫度(22℃、26℃、28℃、30℃和35℃)對發(fā)酵的影響。

1.6 發(fā)酵液中安福霉素效價測定

采用HPLC法分析發(fā)酵液中安福霉素效價。HPLC 條件:色譜柱，ODS C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);流速 1mL/min;柱溫 40℃;檢測波長200 nm;流動相為44%乙腈/水(含0.1%三氟乙酸，V/V)。樣品制備:發(fā)酵液過濾，濾液經(jīng)10 000 r/min離心10min，取上清液即為測定液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取安福霉素對照品約49.30 mg，精密稱定，置25mL量瓶中，用超純水溶解并定容，搖勻，制成濃度為1.972 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。將安福霉素對照品標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液以超純水稀釋，制成 0.049 mg/mL、0.099 mg/mL、0.197 mg/mL、0.395 mg/mL、0.986 mg/mL、1.972 mg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析。以安福霉素濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，安福霉素峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=20 000 000X －658 392，R2=0.999 1。根據(jù)樣品峰面積/標(biāo)準(zhǔn)液峰面積 ×標(biāo)準(zhǔn)液濃度計算效價。

1.7 發(fā)酵實證

采用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方和優(yōu)化后發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵試驗，考察安福霉素的最終發(fā)酵效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)選

2.1.1 碳源的選擇 參考 Heinemann B等［10］專利報道的發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)置原始發(fā)酵培養(yǎng)基成分，并設(shè)為對照培養(yǎng)基(發(fā)酵液中安福霉素相對效價設(shè)為100)，分別使用甘油、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖作為碳源以相同比例替代原始培養(yǎng)基中的碳源(葡萄糖)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，考察不同碳源對安福霉素效價的影響。結(jié)果如圖1，以蔗糖作為碳源，安福霉素的效價有顯著的提高。因此，優(yōu)選蔗糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

圖1 不同碳源對安福霉素發(fā)酵水平的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on amphomycin production.

2.1.2 氮源的選擇 以原始發(fā)酵培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基(安福霉素相對效價100)，分別使用棉籽粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨作為氮源以相同比例替代原始培養(yǎng)基中的氮源(黃豆粉)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，考察不同氮源對安福霉素產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2。以黃豆粉作為氮源，安福霉素的效價較高，而棉籽粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨4種氮源對安福霉素的產(chǎn)量提高沒有明顯作用。因此，優(yōu)選黃豆粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

圖2 不同氮源對安福霉素發(fā)酵水平的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on amphomycin production.

2.1.3 氨基酸前體對發(fā)酵的影響 以甘氨酸等14種氨基酸作為前體，在發(fā)酵培養(yǎng)基中各加入至終濃度為0.1%(V/V)，考察其對安福霉素生物合成的影響，結(jié)果如圖3所示。添加精氨酸、組氨酸、脯氨酸的發(fā)酵液安福霉素效價比無氨基酸前體添加的空白對照提高20%以上，添加谷氨酸以及酪氨酸對安福霉素合成的影響不大，添加甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸等對安福霉素的合成有抑制作用。因此，優(yōu)選組氨酸作為前體加入發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖3 氨基酸對對安福霉素發(fā)酵水平的影響Fig.3 Effects of Amino acids on amphomycin production.

2.1.4 無機(jī)鹽的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入 0.1% 的 KNO3、FeSO4、ZnSO4、MgSO4和 CaCO3，比較上述5中無機(jī)鹽的添加對發(fā)酵效價的影響，結(jié)果見圖4。不同無機(jī)鹽的添加對安福霉素合成能力影響不同，其效果從高到低排序為KNO3＞CaCO3＞MgSO4＞FeSO4＞ZnSO4，添加 KNO3可提高安福霉素產(chǎn)量水平50%以上，CaCO3可提高20%安福霉素產(chǎn)量，添加MgSO4后安福霉素產(chǎn)量略有提高，F(xiàn)eSO4和ZnSO4會降低安福霉素的產(chǎn)量。因此，綜合考慮可選擇KNO3和CaCO3作為培養(yǎng)基優(yōu)化配方中的無機(jī)鹽組分。

圖4 無機(jī)鹽對對安福霉素發(fā)酵水平的影響Fig.4 Effects of inorganic salts on amphomycin production.

2.1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗 根據(jù)上述實驗結(jié)果，選擇蔗糖、黃豆粉、組氨酸和KNO3作為發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分，設(shè)計L9(34)正交試驗綜合考察培養(yǎng)基各成分對產(chǎn)安福霉素的影響，結(jié)果見表2。根據(jù)正交設(shè)計助手軟件分析，對產(chǎn)安福霉素的影響主次順序為:B＞A＞D＞C，即黃豆粉＞組氨酸＞KNO3＞蔗糖。其優(yōu)勢組合為A1 B2 C2 D1，即得到合適的培養(yǎng)基配方為:蔗糖1.5%，黃豆粉1.0%，組氨酸 0.1%，硝酸鉀 0.1%。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of L9(34)orthogonal test.

2.2 搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 種齡對發(fā)酵的影響 種齡的控制是發(fā)酵能否正常進(jìn)行的關(guān)鍵因素之一。在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，最適種齡一般都選在菌種對數(shù)生長期。圖5顯示，種齡54 h時，安福霉素效價最高。

圖5 不同種齡對安福霉素效價的影響Fig.5 Effects of different cultivation time of seed on amphomycin production.

2.2.2 接種量對發(fā)酵的影響 在發(fā)酵過程中，接種量的大小是由菌體的生長繁殖速度決定的，也是保證發(fā)酵正常進(jìn)行的一個關(guān)鍵因素。圖6顯示，接種量2%時，安福霉素發(fā)酵效價最高。

圖6 不同接種量對安福霉素效價的影響Fig.6 Effects of different inoculum size on amphomycin production.

2.2.3 裝液量對發(fā)酵的影響 結(jié)果如圖7所示，安福霉素的產(chǎn)量隨著裝液量的增加而提高，但考慮到裝液量過多易造成染菌，故選擇裝液量120mL作為最佳條件。

2.2.4 發(fā)酵周期對發(fā)酵的影響 抗生素產(chǎn)生菌在發(fā)酵過程中，抗生素的產(chǎn)率與發(fā)酵周期密切相關(guān)。圖8顯示，該鏈霉菌產(chǎn)安福霉素效價在發(fā)酵120 h左右達(dá)到最高。

圖7 不同裝液量對安福霉素效價的影響Fig.7 Effects of different medium volume on amphomycin production.

圖8 發(fā)酵周期對安福霉素效價的影響Fig.8 Effects of fermentation time on amphomycin production.

2.2.5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響 微生物有其最適和耐受的溫度范圍，同一種微生物在不同的生長階段和不同的生理生化過程中，最適溫度往往也不相同。由圖9可知，溫度為28℃時，鏈霉菌產(chǎn)安福霉素的產(chǎn)量最高，因此最宜的發(fā)酵溫度為28℃。

圖9 發(fā)酵溫度對安福霉素效價的影響Fig.9 Effects of fermentation temperature on amphomycin production.

2.3 優(yōu)化發(fā)酵條件的驗證

在綜合最優(yōu)條件下，對鏈霉菌菌株Streptomyces canus sp.FIM-0916進(jìn)行5批發(fā)酵驗證試驗，結(jié)果顯示在最佳培養(yǎng)基配方和優(yōu)化發(fā)酵條件下，發(fā)酵液相對效價分別為 367.3、301.3、400.1、356.2 和313.0，平均相對效價347.6，發(fā)酵水平提高了248%以上。優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成效較顯著，優(yōu)化發(fā)酵條件下的發(fā)酵液中安福霉素產(chǎn)量顯著提高。

3 討論

高產(chǎn)菌株的特性不僅由其遺傳特性決定，而且也由其所處的環(huán)境條件和菌體生長變化決定。發(fā)酵法生產(chǎn)次級代謝物除了受菌種的影響外，培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)條件等對產(chǎn)量影響也很大。在生產(chǎn)上，有了優(yōu)良的菌種后，還需要有最佳的環(huán)境條件即發(fā)酵工藝加以配合。否則，即使有了優(yōu)良菌種，菌種的生產(chǎn)能力也不能充分體現(xiàn)。因此，探索菌株高產(chǎn)特性充分表達(dá)的最佳培養(yǎng)條件是發(fā)酵生產(chǎn)的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。

安福霉素是近年來研究較多的環(huán)脂肽類化合物，據(jù)報道其發(fā)酵水平較低，國內(nèi)也沒有安福霉素發(fā)酵相關(guān)的報道，本實驗室前期通過對鏈霉菌(Streptomyces canus sp.)進(jìn)行菌種篩選，獲得了一株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株 Streptomyces canus sp.FIM-0916，本文對其發(fā)酵培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了考察。實驗結(jié)果顯示該菌株對于胨類或提取物類等水解完全的氮源利用率較差，而對黃豆粉這一粗放氮源利用率較好，可能是較為粗放的氮源含有不同水解程度的蛋白質(zhì)和氨基酸等，對于其后期次級代謝合成目標(biāo)產(chǎn)物有不同程度的影響;不同碳源對該菌株發(fā)酵產(chǎn)安福霉素的影響較大，可能是其發(fā)酵前期對于不同碳源組成的利用能力的差別，導(dǎo)致菌體生長速度的不同，從而引起后期次級代謝產(chǎn)物合成發(fā)酵結(jié)果的不同，實驗結(jié)果顯示蔗糖的利用效果最佳，明顯好于文獻(xiàn)報道［10］的葡萄糖。在微生物發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)補(bǔ)加氨基酸可以增加相應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量［11，12］。本實驗亦證明，鏈霉菌菌株Streptomyces canus sp.FIM-0916生物合成安福霉素過程中，添加適量的精氨酸、組氨酸和脯氨酸對產(chǎn)安福霉素均有促進(jìn)作用，其原因可能是這幾種氨基酸通過特定代謝途徑產(chǎn)生目的代謝途徑中所需的輔酶或中間代謝物包括前體物，抑制或激活相關(guān)代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而促進(jìn)目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高［13，14］。無機(jī)鹽類是微生物生長不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽成分，可提高抗生素的產(chǎn)率［15］。本實驗顯示，添加適宜的KNO3和CaCO3對產(chǎn)安福霉素均有促進(jìn)作用，其原因可能是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓、pH等，促進(jìn)該菌株生物合成目標(biāo)產(chǎn)物。

通過單因素試驗結(jié)果分析，進(jìn)一步結(jié)合正交試驗優(yōu)化，本文考察了鏈霉素菌株Streptomyces canus sp.FIM-0916的發(fā)酵條件，最終篩選獲得了適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基組成:蔗糖1.5%，黃豆粉1.0%，組氨酸 0.1%，KNO30.1% 和 CaCO30.1%;確定了最佳發(fā)酵條件:種子菌齡 54 h，裝液量120mL/500mL，接種量2%，發(fā)酵溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min;最佳發(fā)酵時間為5 d。該菌株優(yōu)化后的搖瓶發(fā)酵條件與初始條件相比，安福霉素的發(fā)酵單位提高了3.5倍。通過對培養(yǎng)基組成的研究和發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化，不僅在如何提高安福霉素產(chǎn)量上有了更加深入的認(rèn)識，也為安福霉素發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。影響鏈霉菌(Streptomyces canus sp.)生產(chǎn)次生代謝物的因素很多。產(chǎn)物的誘導(dǎo)或抑制，菌體分散成菌絲或聚集成團(tuán)與產(chǎn)物合成之間的關(guān)系，以及生長因子或表面活性劑對生物合成目標(biāo)產(chǎn)物的影響等，均有待深入地研究。

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