顏曉睿 宮麗鴻

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

穩(wěn)斑湯對ApoE基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊HSP70表達的影響*

顏曉睿1宮麗鴻2△

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

目的 觀察搜風祛痰法中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯對ApoE基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化（AS）不穩(wěn)定斑塊HSP70表達的影響。方法 ApoE基因敲除小鼠高質(zhì)飲食喂養(yǎng)13周后，待其形成成熟的AS斑塊，隨機分為模型組、穩(wěn)斑湯低劑量組、穩(wěn)斑湯中劑量組、穩(wěn)斑湯高劑量組、西藥組、空白對照組。各組相應(yīng)處理13周后，取主動脈組織HE染色后在光學(xué)顯微鏡下進行病理學(xué)觀察，然后采用免疫組化和RT-PCR技術(shù)檢測HSP70的表達水平。結(jié)果 治療組主動脈組織中HSP70表達水平高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），穩(wěn)斑湯高劑量組HSP70表達水平與西藥組無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 捜風祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯可通過影響HSP70以穩(wěn)定易損斑塊，其機制可能與HSP70對心血管系統(tǒng)的保護作用相關(guān)。

搜風祛痰法 復(fù)方穩(wěn)斑湯 ApoE基因敲除小鼠 動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊 HSP70

近年來，由心血管事件引發(fā)的死亡率已超過感染性疾病躍居第一位，預(yù)計到2020年，每年將有2.5億人患有心血管疾病，而其中1/3的人將死于急性冠脈綜合征（ACS）［1］。研究表明，炎癥啟動灌裝動脈粥樣硬化的發(fā)生并影響其進程，使AS斑塊變得不穩(wěn)定，引起ACS。斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)、全身性炎癥反應(yīng)以及感染均可影響斑塊的穩(wěn)定性［2］。熱休克蛋白（HSP），也稱應(yīng)激蛋白，是一類在結(jié)構(gòu)上高度保守的蛋白，廣泛存在于原核生物和真核生物中［3］。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70無論在正常還是在應(yīng)激情況下，對細胞的蛋白合成均發(fā)揮重要作用，尤其在心肌缺血過程中，不僅是細胞受損的標志，也是細胞的保護因子。HSP70在細胞內(nèi)過量表達對一定時間內(nèi)的嚴重心肌缺血有保護作用［4］。本研究旨在觀察捜風祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯對ApoE基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊內(nèi)HSP70表達的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡ApoE基因缺陷鼠（系C57BL/6J，北京大學(xué)實驗動物中心美國Jackson實驗室引進并培育成功）70只，SPF級，體質(zhì)量18～20g。

1.2 藥物與試劑 藥物為穩(wěn)斑湯，組成為全蝎5g，蜈蚣2g，地龍15g，陳皮15g，半夏15g，白術(shù)15g，水蛭15g。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，加工制成含生藥2g/mL的中藥濃縮液備用。相關(guān)抗體（北京博奧森生物科技有限公司）。SP試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。DAB顯色試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。兩步法RT-PCR試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實驗方法 （1）造模。小鼠予高脂飼料喂養(yǎng)13周后，隨機處死4只，取主動脈根部，HE染色觀察AS硬化程度，確定造模成功。（2）分組及中藥干預(yù)。ApoE基因敲除小鼠60只隨機分為5組每組12只：模型組、穩(wěn)斑湯低劑量組、穩(wěn)斑湯中劑量組、穩(wěn)斑湯高劑量組及西藥組。根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體質(zhì)量折算系數(shù)9.0折算成小鼠用量，穩(wěn)斑湯低劑量組：61.75g/（kg·d），穩(wěn)斑湯中劑量組123.5g/（kg·d），穩(wěn)斑湯高劑量組247g/（kg·d），西藥組0.27g/（kg·d），模型組給予0.9％氯化鈉注射液0.3mL/d。按體質(zhì)量系數(shù)比折算成小鼠用量灌胃給藥，每日1次。正常C57BL/6J小鼠12只正常飼料喂養(yǎng)13周，設(shè)為空白對照組。 取材前夜禁食，經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢采血，離心分離血清，-80℃凍存，用作測定血清HSP70水平。處死全部小鼠，無菌條件下取出心臟及主動脈，心臟10％甲醛固定，主動脈放在凍存管內(nèi)液氮驟冷保存。

1.4 檢測方法 （1）主動脈組織病理學(xué)觀察。每組隨機取5只小鼠，麻醉處死，無菌條件下在每只小鼠的主動脈根部取4個相同的切面，分別為：①升主動脈最近端橫截面，切面形態(tài)呈圓形；②主動脈瓣附著部位，并有冠狀動脈開口；③主動脈瓣起始橫截面；④主動脈瓣完全出現(xiàn)并匯合在一起，0.9％氯化鈉注射液沖洗，10％甲醛中性溶液固定。常規(guī)石蠟包埋，均勻間斷切片，厚5μm。HE染色，普通光鏡下觀察主動脈根部組織及斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)；Masson染色，普通光鏡下觀察各斑塊中纖維成分的分布。用計算機彩色圖像處理系統(tǒng)測量血管內(nèi)膜厚度，斑塊面積，管腔面積，脂質(zhì)核心面積，斑塊中除膠原和纖維成分以外的斑塊面積，最小纖維帽厚度。（2）免疫組織化學(xué)檢測。采用SP法，常規(guī)滴加一抗，二抗，DAB顯色蘇木精復(fù)染，高倍視野下計數(shù)浸潤于內(nèi)膜的單核細胞數(shù)。以染色系數(shù)統(tǒng)計HSP70免疫組化染色結(jié)果。（3）實時定量RT-PCR檢測。先提取總RNA，然后取4μL總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶及隨機引物等反應(yīng)物混合配成20μL體系，42℃15min，95℃，2min反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，分別對小鼠HSP70的表達進行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料數(shù)據(jù)以（±s）表示。組間比較用t檢驗，多組均數(shù)比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)改變 各組小鼠主動脈HE染色形態(tài)學(xué)改變?nèi)缦?。空白對照組：動脈內(nèi)膜附有一層內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮細胞層呈現(xiàn)皺褶狀排列，但排列均勻，表面光滑，未見泡沫細胞及炎性細胞（圖1A）。模型組：血管腔內(nèi)可見明顯的粥樣硬化斑塊出現(xiàn)，斑塊表面附有纖維帽，纖維帽主要由平滑肌細胞、彈力纖維和膠原組織構(gòu)成，斑塊中央可見大量的脂質(zhì)聚集，斑塊內(nèi)可見大量泡沫細胞，偶見炎性細胞浸潤。未出現(xiàn)斑塊的動脈內(nèi)膜區(qū)域嚴重破損（圖1B）。穩(wěn)斑湯低劑量組：血管腔內(nèi)可見粥樣硬化斑塊，斑塊面積明顯小于模型對照組，斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量較模型組少，斑塊內(nèi)可見少量泡沫細胞及炎性細胞。未出現(xiàn)斑塊的動脈內(nèi)膜區(qū)域形態(tài)較為完整，偶見內(nèi)膜殘缺（圖1C）。穩(wěn)斑湯中劑量組（圖1D）、穩(wěn)斑湯高劑量（圖1E）、西藥組（圖1F）：動脈內(nèi)膜大部分較為光滑，偶見內(nèi)膜不全，內(nèi)膜不全區(qū)域可見明顯的脂質(zhì)條紋塊形成，偶見泡沫細胞聚集，有少量纖維成分交聯(lián)（見圖1）。

圖1 光鏡下各組小鼠腹主動脈根部組織及斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變（HE染色，×100）

2.2 免疫組化 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70主要表達于細胞漿中，陽性表達產(chǎn)物呈棕褐色顆粒，粥樣硬化斑塊中主要表達于纖維帽的平滑肌細胞胞漿中。空白對照組小鼠動脈內(nèi)膜細胞胞漿內(nèi)可見大量陽性表達顆粒（見圖2A），模型組小鼠動脈組織切片中陽性表達物明顯減少（見圖2B），各治療組表達水平高于模型組（見圖2）。

圖2 高倍視野下以染色系數(shù)統(tǒng)計HSP70免疫組化染色結(jié)果（DAB顯色，×100）

2.3 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70表達水平 見表1、表2、圖3。給藥13周后，在斑塊內(nèi)HSP70表達水平方面，穩(wěn)斑湯各劑量組與西藥組較模型組明顯增高（P＜0.05），與空白對照組比較明顯增高（P＜0.01），穩(wěn)斑湯高劑量組與西藥組較模型組明顯增高（P＜0.01），穩(wěn)斑湯高劑量組與西藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70蛋白表達水平（±s）

表1 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70蛋白表達水平（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n空白對照組 10模型組 10穩(wěn)斑湯中藥低劑量組 10 HSP70表達水平0.201±0.013 0.169±0.009*0.210±0.011*穩(wěn)斑湯中藥中劑量組 10 0.219±0.014*△穩(wěn)斑湯中藥高劑量組 10 0.246±0.006*△△西藥組 10 0.242±0.015*△△

表2 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70mRNA表達水平（±s）

表2 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70mRNA表達水平（±s）

組 別 n空白對照組 10模型組 10穩(wěn)斑湯中藥低劑量組 10 HSP70 mRNA表達水平0.291±0.030 0.233±0.028*0.285±0.028△穩(wěn)斑湯中藥中劑量組 10 0.343±0.020*△穩(wěn)斑湯中藥高劑量組 10 0.382±0.012*△西藥組 10 0.413±0.021*△

圖3 各組小鼠腹主動脈組織中HSP70mRNA表達電泳圖

3 討論

AS是一個復(fù)雜的病理進展過程，其發(fā)病機制至今尚未完全明了，目前多認為AS是一個炎癥過程［5］，與內(nèi)皮細胞受損、平滑肌細胞增殖［6］、炎癥細胞浸潤等因素密切相關(guān)。局部炎癥細胞的浸潤以及全身性炎癥是導(dǎo)致易損斑塊潰瘍、破裂導(dǎo)致血栓形成，是臨床ACS的主要病理學(xué)基礎(chǔ)［7］。而斑塊破裂是導(dǎo)致ACS的主要原因，因此穩(wěn)定易損斑塊為當今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點。

HSP70是主要的伴侶蛋白，發(fā)揮“分子伴侶”作用，促進新生多肽鏈的正常折疊，協(xié)助新生蛋白質(zhì)的合成和修復(fù)損傷的蛋白質(zhì)，維持蛋白質(zhì)合理構(gòu)象；對分子重排、蛋白質(zhì)集聚和新生多肽的跨膜轉(zhuǎn)運具有輔助作用，減少細胞凋亡，修復(fù)離子通道；激活某些酶的作用以保護細胞的生成與功能［3］，對心肌細胞有強大的保護作用。

ACS屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”、“真心痛”的范疇，為本虛標實之證，本虛多為氣虛，標實則為血瘀、痰濁。痰瘀互結(jié)，日久蘊熱，熱極生風相互促生，日久不化，釀成濁脂，浸于脈管，誘發(fā)機體炎癥反應(yīng)，使AS形成不斷增大甚至破裂；痰為百病之崇，風為百病之長，善行而數(shù)變，故發(fā)為不穩(wěn)定型心絞痛或心肌梗死，因此可應(yīng)用搜風祛痰中藥穩(wěn)定粥樣硬化斑塊。藥理研究顯示，全蝎能夠增強心肌收縮力、擴張血管、降低血壓、抗血栓形成；蜈蚣能抗心肌缺血、擴張血管、增強心肌收縮力；地龍能激活纖溶酶原；陳皮能抑制血小板聚集，降低血脂，降低血液高凝狀態(tài)，預(yù)防動脈粥樣硬化；水蛭能抗血栓形成，降低血液黏稠度，調(diào)血脂，防止動脈粥樣硬化，而實驗結(jié)果表明穩(wěn)斑湯能明顯提高HSP70的表達，從而保護心血管系統(tǒng)并穩(wěn)定易損斑塊。

綜上所述，穩(wěn)斑湯在臨床推薦劑量上可通過影響HSP70的表達來穩(wěn)定易損斑塊，其機制與HSP70對心血管系統(tǒng)的保護作用有關(guān)，且療效與西藥阿托伐他汀無明顯差異，毒副作用較小，具有一定的經(jīng)濟價值和社會價值。

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Effect of Stablizing Plaque Decoction on Unstable Plaque HSP70（Heat Shock Protein 70）Expression of ApoE Knockout Rats with AS

YAN Xiaorui，GONG Lihong.
Liaoning Traditional Chinese Medical University，Liaoning，Shengyang 110032，China

Objective：To explore the effect of compound stablizing plaque decoction on unstable plaque HSP70（Heat Shock Protein 70）expression of ApoE knockout rats with AS.Methods：70 ApoE knockout mice were fed a high-fat diet for 13 weeks until the mature atherosclerotic plaques were formed.Thereafter，they were randomly divided into the model group，low-dose，medium-dose，high-dose of stabilizing plaque decoction groups，western medicine control group，and normal group.After 13 weeks，aortic tissues of each group were fetched to observe under an optical microscope after HE staining.And then immunohistochemical methods and RT-PCR technique were used to detect the level of HSP70 expression.Results：The HSP70 expression levels in aortic tissue of mice in the treatment groups were higher than control group（P＜0.05或P＜0.01），and the expression levels of HSP70 between TCM high-dose group and western medicine group had no significant differences（P＞0.05）.Conclusion：Searching wind and eliminating phlegm compound stabilizing plaque decoction may stabilize plaques by influencing the HSP70，and its mechanism may be associated with its protection for the cardiovascular system.

Searching wind and eliminating phlegm method；Compound stabilizing plaque decoction；ApoE knockout mice；AS unstable plaque；HSP70

R285.5

A

1004-745X（2014）10-1782-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.004

2014-06-21）

中國博士后面上項目（No.20110491540）；遼寧省百千萬人才項目（No.2011921022）

△通信作者