楊 震 曹 陽(yáng) 張立春 嚴(yán)昌國(guó) 梁成云 李官浩 金海國(guó)

YANG Zhen1，2 CAO Yang 2 ZHANG Lic－h(huán)un2 YAN Chang－guo1 LIANG Cheng－yun1 LI Guan－h(huán)ao1 JIN Hai－guo2

（1.延邊大學(xué)，吉林 延邊 133002；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院，吉林 公主嶺 136100）

（1.College of Agriculture，Yanbian University，Yanji，Jilin 133002，China；2.Branch of Animal Husbandry，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Gongzhuling，Jilin 136100，China）

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs），是核內(nèi)激素手提家族中最具代表性的一元，過氧化物酶體可使其激活，從而增加其數(shù)量和體積［1，2］。PPARγ是PPAR家族中最具脂肪細(xì)胞專一性的成員，而且它在脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)過程中是在大多數(shù)脂肪細(xì)胞特異基因的表達(dá)之前被誘導(dǎo)的，在脂肪組織內(nèi)均表達(dá)豐富，具有控制和調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)貯存［3－5］，影響 胰 島 素 的 作 用，可 調(diào) 節(jié) 體 內(nèi) 葡 萄 糖 平 衡［6－8］。PPARγ基因是脂肪細(xì)胞分化的特定轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)量可增加脂肪細(xì)胞的分化，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的成熟。同時(shí)，PPARγ信號(hào)通路控制脂質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、貯存和消化［9］。PPARγ基因同樣可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化［10，11］，并 激 活 與 脂 類 代 謝 相 關(guān) 的 基 因，如 脂 蛋 白 脂 酶（LPL）、脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）等［12－14］。

肉類的經(jīng)濟(jì)性狀一般都是由多個(gè)基因調(diào)控影響的［15］，利用單核苷酸多態(tài)性（SNP）技術(shù)尋找候選基因功能區(qū)域和經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析，已被廣泛應(yīng)用于牛功能基因的篩選［16－20］。此外，突變表型的差異是影響肉類動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)鍵因素［21］。體脂、腹脂、肌內(nèi)脂肪以及肌纖維的數(shù)量和體積等均是評(píng)價(jià)牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，其中肌內(nèi)脂肪含量尤為重要。肌內(nèi)脂肪主要由分布在肌內(nèi)外膜和肌束膜的脂肪構(gòu)成，其中含有油酸、亞油酸、亞麻酸等對(duì)人體健康有益的多種不飽和脂肪酸［22］。肌內(nèi)脂肪含量豐富的牛肉斷面呈現(xiàn)不規(guī)則的大理石紋狀，其肉質(zhì)柔軟鮮嫩多汁。脂肪細(xì)胞的體積和數(shù)量是衡量動(dòng)物肌內(nèi)脂肪含量的重要指標(biāo)［23］。本試驗(yàn)擬采用PCR—單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）技術(shù)檢測(cè)延邊黃牛PPARG基因單核苷酸多態(tài)性，并將其與延邊黃牛肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，以期找到延邊黃牛在該基因上的多態(tài)位點(diǎn)和多態(tài)信息，發(fā)現(xiàn)新的影響延邊黃牛牛肉品質(zhì)的分子標(biāo)記，從而改善延邊黃牛牛肉品質(zhì)和生產(chǎn)性能。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

供試群體延邊黃牛83頭統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于吉林省琿春市吉興牧場(chǎng)，采用ACD抗凝（VACD∶V血液＝1∶6）方法頸椎靜脈取血10 m L，將標(biāo)記好的血樣保存于－20℃冰箱。

1.2 主要試劑

PMD18－T Vector：中國(guó) TaKaRa公司；

DNA凝膠回收試劑盒：美國(guó)Axygen公司；

D2000 Marker、d NTPs、10×PCR Buffer、DNA 聚合酶：北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取 利用AxyPrep公司生產(chǎn)的血液基因組DNA小量制備試劑盒提取延邊黃牛血液基因組DNA，最后在1%瓊脂糖水平電泳中檢測(cè)延邊黃?；蚪M的完整性和純度，將完整性和純度較好的基因組保存于－20℃冰箱。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的黃牛PPARG基因序列（Gene ID：281993），利 用 Oligo 7.37 和Primer Premier 5.0等軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為185 bp，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物序列：

（1）上游引物 F：5＇－AAGAAGCCCATTCCCAGATAC－3＇

（2）下游引物 R：5＇－ACCTTCCTAGTGCCATCCAG－3＇

1.3.3 PCR 擴(kuò) 增 PCR 反 應(yīng) 體 系 為 20μL：DNA 模板1.0μL，上下游引物各0.6μL，DNA 聚合酶0.8μL，d NTPs 1.0μL，10×PCR Buffer 2.0μL，加水補(bǔ)至20μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，66.5℃復(fù)性40 s，72℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)，72℃再延伸8 min，最后于2.0%瓊脂糖水平電泳中檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.3.4 PCR－SSCP 分 析 將 2.5μL 的 PCR 產(chǎn) 物和7.5μL的Loading Buffer混合于小離心管中，放于100℃水浴鍋中變性10 min，然后將變性后的混合物迅速冰浴10 min，最后用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis為29∶1）檢測(cè)分型。電泳條件：電壓160 V，18 h，溫度4℃，1×TBE電泳緩沖液。經(jīng)硝酸銀染色后，進(jìn)行基因分型，每個(gè)基因型隨機(jī)挑選10個(gè)樣品送于北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，并用DNAStar7.0等軟件進(jìn)行序列對(duì)比。

1.3.5 肉質(zhì)性狀測(cè)定 隨機(jī)挑選21頭延邊黃牛進(jìn)行屠宰，并測(cè)定其肉質(zhì)性狀，包括顏色、p H24值、剪切力、蒸煮損失和眼肌面積。

1.3.6 序列分析與數(shù)據(jù)處理 利用DNAstar7.0等軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和比對(duì)；并利用SPSS 19.0軟件對(duì)基因型與延邊黃牛肉質(zhì)性狀的進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，肉質(zhì)性狀指標(biāo)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)差組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的PPARG基因特異性引物，在延邊黃牛群體能很好的擴(kuò)增出185 bp的目的片段（見圖1），無(wú)非特異性條帶，可以用于PCR－SSCP分析。

圖1 PPARG基因PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 1%agarose gel electrophoresis of PCR products in PPARG Gene

2.2 PCR－SSCP檢測(cè)結(jié)果

PCR－SSCP檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，延邊黃牛群體可分為3種基因型（見圖2），分別定義為CC、TT和CT。

圖2 PPARG基因PCR－SSCP檢測(cè)結(jié)果Figure 2 SSCP test results of PCR products in PPARG Gene

2.3 序列分析結(jié)果

利用DNAStar7.0軟件將測(cè)序序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的黃牛序列（Gene ID：281993）比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，在26 106 bp處TT基因型發(fā)生了A→G的突變。比對(duì)結(jié)果見圖3。

2.4 基因頻率和基因型頻率分析

圖3 純合個(gè)體基因型和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中黃牛PPARG基因序列的比對(duì)Figure 3 Homozygous genotype and the NCBI database of genetic sequences of cattle for PPARG

經(jīng)PCR－SSCP分型后統(tǒng)計(jì)基因型頻率及等位基因頻率結(jié)果見表1。由表1可知，C等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，基因型CC為優(yōu)勢(shì)基因型，并且經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，延邊黃牛處于Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.5 不同基因型與延邊黃牛部分肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

表1 延邊黃牛PPARG基因等位基因頻率及基因型頻率分布Table 1 Distribution of genotype and allele frequencies of PPARG gene in Yanbian cattle

表1 延邊黃牛PPARG基因等位基因頻率及基因型頻率分布Table 1 Distribution of genotype and allele frequencies of PPARG gene in Yanbian cattle

df 0.05（1）＝3.84。

群體數(shù)量／頭基因型頻率 等位基因頻率TT CT CC T C X2延邊黃牛83 0.132 5 0.349 4 0.518 1 0.307 2 0.692 8 2.665 3

利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)延邊黃牛部分肉質(zhì)性狀進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表2）表明，TT基因型所對(duì)應(yīng)的個(gè)體CIE L＊、蒸煮損失和眼肌面積顯著高于CT和CC基因型個(gè)體，剪切力顯著低于CT和CC基因型個(gè)體，且差異顯著（P＜0.05）。CC、CT、TT 3種基因型在其余肉質(zhì)性狀上無(wú)顯著差異。

3 討論

表2 PPARG基因各基因型肉質(zhì)性狀均值差異顯著性檢驗(yàn)Table 2 Significance test of meat trait means for different genotypes of PPARG gene

表2 PPARG基因各基因型肉質(zhì)性狀均值差異顯著性檢驗(yàn)Table 2 Significance test of meat trait means for different genotypes of PPARG gene

同行數(shù)據(jù)上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）；同行數(shù)據(jù)上標(biāo)不同大寫字母表示差異顯著（P＜0.01）；字母相同或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著（P＞0.05）；p H 24表示24 h所測(cè)p H值。

基因型 CIE L＊ CIE a＊ CIE b＊ p H 24值 剪切力 蒸煮損失 眼肌面積CC 40.00±0.19bB 9.62±0.46 7.89±0.42 5.52±0.01 91.90±1.03a 0.43±0.00b 78.47±8.29bB CT 40.47±0.31bAB 9.65±0.95 7.87±0.66 5.49±0.01 88.43±1.29b 0.44±0.00ab 79.40±6.52bB TT 41.77±0.20aA 9.87±0.81 8.57±0.46 5.46±0.02 85.77±1.44b 0.45±0.00a 87.95±8.31aA

PPARG基因多態(tài)性與延邊黃牛部分肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析表明：基因型TT對(duì)肉亮度CIE L＊和眼肌面積有影響且極顯著高于CC、CT 2個(gè)基因型個(gè)體（P＜0.01），基因型TT對(duì)剪切力有影響且顯著低于CC、CT 2個(gè)基因型個(gè)體（P＜0.05），基因型TT對(duì)蒸煮損失也有影響且顯著高于CC、CT 2個(gè)基因型個(gè)體（P＜0.05），但 CC、CT、TT 3種基因型在肉紅色度、黃色度及p H24值無(wú)顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果表明PPARG基因可作為影響肉牛肌內(nèi)脂肪沉積的重要候選基因，用于分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）育種。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C等位基因是群體中的優(yōu)勢(shì)等位基因，但含有T等位基因個(gè)體的肉質(zhì)性狀指標(biāo)優(yōu)于其他個(gè)體。因此，推測(cè)等位基因T可能影響肉牛的體質(zhì)量和脂肪沉積，為地方優(yōu)勢(shì)等位基因，其結(jié)果需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

綜上所述，PPARG基因多態(tài)性對(duì)延邊黃牛肉質(zhì)性狀有一定影響，在脂肪沉積方面尤為突出。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于PPARG基因在延邊黃牛肌內(nèi)脂肪含量的研究較少，本試驗(yàn)通過對(duì)延邊黃牛PPARG基因多態(tài)性研究為其功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)。并可依據(jù)該基因多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)延邊黃牛的肉質(zhì)性狀進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，促進(jìn)延邊黃牛的分子育種進(jìn)程。

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